第二节 蛋白质的定性测定 （自学）
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合 并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
第三节 蛋白质的定量测定
测定总氮量→ N%×F =粗蛋白质含量%
因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白 质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物 碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。
⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易 产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始 消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注 意控制热源强度。
⑦ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续
！！！
一、 凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微 量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。
改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。 主要改良催化剂及消化蒸馏装置。
（一）常量凯氏定氮法
原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
<3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
凯氏定氮法注意事项
1、硫酸钾 及 硫酸铜的作用 2、火候控制 3、装置的气 密性 4、何时加碱 5、难消化的 对策 6、停止蒸馏
图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a．消化装置 b．蒸馏吸收装置
自动回流消化蒸馏仪
2. 蒸馏与吸收
消化液 + 40%氢氧化 钠加热蒸馏，放出氨 气。 “以奈氏试剂” 检查。
加热消化。
⑧ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于 含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组 氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如 大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色， 但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑨蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则 将发生倒吸现象。
2、蒸馏与吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4
2NH3↑+Na2SO4 + 2H2O
2NH3 + 4H3BO3
（NH4）2B4O7 + 5HБайду номын сангаасO
3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl
2NH4Cl + 4H3BO3
(注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )
〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 检验NH4+离子，析出黄色或红 棕色沉淀。
同时用4%硼酸吸收
3. 滴定
用HCl滴定 用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红）
终点：蓝色→微红色
计算：
蛋 白 质 （ % ） C （ V V 0 ） 0 .0 1 4 0 1 F 1 0 0 m
F要根据样品来源定
3学时
说明及注意：
①本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗 蛋白质）。结果准确，但费时。
②所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
③同时作一空白试验，从消化开始到滴定 。
④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘 贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在 的情况下消化不完全而造成氮损失。
整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定
1. 消化
要防止暴沸
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、 汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl滴定或H2SO4溶液滴定。 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再 以标准NaOH滴定过量的酸。
为什么？
凯氏定氮法原理（方程式）
催化剂
1、消化：NCOC + 浓H2SO4 煮沸 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O
鸡肉 鸭 兔肉 牛肉 猪肉 带鱼 21.5 16.5 21.2 20.1 9.5 18.1 大豆 稻米 菠菜 苹果 黄瓜 牛乳 36.3 8.5 2.4 0.4 0.8 3.5
测定意义： ✓评价食品的营养价值。
✓为合理开发利用食物资源，提高产品质量， 优化食品配方及生产过程控制提供依据。
蛋白质的测定方法： 分两大类 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
蛋白质和氨基酸的 测定
第八章 蛋白质和氨基酸的测定
§8-1 概述 §8-2 蛋白质的定性测定（自学） §8-3 蛋白质的定量测定* （§8-4 蛋白质的末端测定） §8-5 氨基酸的定性测定（自学） §8-6 氨基酸的定量测定* §8-7 氨基酸的分离及测定
本章重点
1. 凯氏定氮法的原理及注意事项。 2. 蛋白质快速测定法有哪些？ 3. 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。
第一节 概述
O
H
||
|
蛋白质是复杂的含氮有机化合物。 C N
蛋白质换算系数F
玉米、鸡蛋、肉 6.25
花生 5.46
乳制品 6.38
大米 5.95
面粉 5.70
大豆及制品 5.71
蛋白质平均含N量（15-17.6）为16% 。
不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性 食品的蛋白质含量高于植物性食品。
等测定蛋白质含量；
另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性
基团、芳香基团等）测定蛋白质含量。
其中： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等——多用于生 产单位质量控制分析。 国外：红外分析仪 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采 用酸碱滴定法来完成。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。