（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
免疫细胞的功能检测
——功能检测的原理及方法
免疫细胞功能检测的意义
免疫系统或其他系统的疾病，免疫接 种，某些临床措施或外界环境的影响，均 可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对 于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、 预防接种的效果评估及环境因素对机体免 疫功能影响的判定，都具有重要意义。

根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考
虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。

红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴
2007级五年制本科生
免疫学实验课
杨 巍
第四次实验课
人外周血单个核细胞分离
实验内容

人外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离与检测技术（讲解）
实验目的


掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或
组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
1ml刻度吸管 1支/4人 加样器(tip) 1把/4人 显微镜 1台/2人
实验步骤
1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)
NOTE：不要打破血液与分层液的界面；
2. 分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层; 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞， 放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次， 4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清； 4. 计数：用500ul PBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。
淋巴细胞分离及检测技术
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
免疫细胞的分离
——免疫细胞的分离原理及方法
免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关 的所有细胞的总称。
— Mononuclear phagocyte system
Monocyte Macrophage Dendritic Cells
—
Granulocytes
原理:绵羊红细胞→T细胞→形如花环，比重变大，离心 沉淀
B细胞膜免疫球蛋白检测
原理：荧光素→抗Ig特异性抗体→B细胞表面膜 免疫球蛋白(mIg)
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二. 免疫细胞的功能检测
淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。
非特异性:有丝分裂原 PHA、ConA…
微生物及其代谢产物
刺激物 蛋白物质 抗体 淋巴因子 特异性：特异性抗原物质
葡萄球菌…
胃蛋白酶… 抗CD3、CD4抗体…
淋巴细胞转化试验的检测方法
(一)形态学方法
淋巴细胞→淋巴母细胞→染色镜检
(二) 3H﹣TdR掺入法
有丝裂原或抗原→淋巴细胞→染色体复制 →3H﹣TdR掺入 →淋巴细胞摄取→测定放射量
(三) MTT比色法
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淋巴细胞亚群检测的方法
（T细胞和B细胞检测方法相同,现以T细胞为例进行讲解.）
Neutrophils Basophils Eosinophils T lymphocyte B lymphocyte NK (Natural killer cells)
—
Lymphocytes
直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞
免疫细胞的分离
一. 外周血单个核细胞（PMBC）分离
细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
Ficoll密度梯度离心法
比重：1.070
比重：1.077
Ficoll
比重：1.092
实验材料
分组：两人一组 器材 滴管 EP管 计数板 数量 2支/2人 1个/2人 1块/2人 试剂 分层液 血液 PBS 计数液 数量 0.5ml /2人 1ml /2人 1瓶/4人 1管/4人
（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 单个核 —— PBMC 血中的细胞
• 无核 —— 红细胞 • 多核 —— 多核白细胞来自密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液 比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
离心前示意图
稀释的抗凝血
Ficoll分离液
APAAP法: APAAP复合物
兔抗鼠IgG
T细胞 McAb
(三)荧光激活细胞分类仪(FACS)检测T细 胞亚群
FACS是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器,其操作程 序在无菌条件下进行,不影响细胞活性,所以分离、收集的细胞可 继续其他细胞功能的研究。
离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
2、T、B淋巴细胞的分离纯化
免疫细胞检测的分类
一、免疫细胞的数量检测
二、免疫细胞的功能检测
免疫细胞自发增殖活性测定
免疫细胞增殖检测
淋巴细胞增殖检测
一. 免疫细胞的数量检测
检查的项目有：血中T细胞与B细胞的分类计数
血液白细胞的计数 血液中白细胞的分类计数
实验方法
｛
E玫瑰花环实验(检测T细胞)
B细胞膜免疫球蛋白检测
E玫瑰花环实验
二. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯化淋巴细胞亚群）
E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术
免疫细胞分离的依据
1. 2. 3. 4. 细胞膜脆性：低渗液分离 细胞密度：密度梯度离心法 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛
（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）
5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。
（NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以 上为淋巴细胞，部分是单核细胞）
示意图
细胞计数方法
4

查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
（1）尼龙毛柱法 ** 原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏 附性的T细胞。 （2）E花环分离法 * 原理：人成熟T细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受 体（E受体），可结合绵羊红细胞形成E花环，比重 增大，沉于管底。 （3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法
E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细胞。
(一)免疫荧光法
(二)免疫酶标法
(三)荧光激活细胞分类仪检测T细胞亚群
(一)免疫荧光法
直接法:荧光素→单克窿抗体→淋巴细胞
间接法:荧光素→第二抗体(羊或兔的抗鼠IgG) →McAb介导→淋巴细胞
(二)免疫酶标法
ABC法:亲和素＋酶标生物素→复合物→生物素化的二抗→McAb介 导和酶催化底物作用→T细胞着色