利胆排石汤对胆结石小鼠脂类代谢及肝组织Ｂ-ＵＧＴ活性的影响梁颖,孙阳,毕克滨,吴勃岩＊(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)摘 要:目的:通过利胆排石汤对实验性胆结石小鼠脂类代谢及肝组织尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Ｂ-ＵＧＴ)活性的影响,观察其对胆结石的抑制作用。
方法:将Ｃ57ＢＬ/6Ｊ小鼠随机分为空白对照组、模型对照组和利胆排石汤给药组,8周后处死并取材,检测血脂水平,结石中胆固醇沉淀量及肝组织中Ｂ-ＵＧＴ活性。
结果:利胆排石汤组和模型对照组小鼠血清ＴＣ和非ＨＤＬ-Ｃ含量差异不显著;利胆排石汤组小鼠结石中胆固醇的沉淀量显著低于模型对照组(Ｐ<0.05);利胆排石汤组小鼠肝组织Ｂ-ＵＧＴ的活性明显高于模型对照组(Ｐ<0.05)。
结论:利胆排石汤可能是通过提高Ｂ-ＵＧＴ活性,影响脂类物质在体内的代谢,实现其治疗胆结石的作用。
关键词:利胆排石汤;胆结石;胆固醇;尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶中图分类号:Ｒ285.5 文献标识码:Ａ 文章编号:1002-2406(2008)04-0077-02基金项目:黑龙江省攻关项目(Ｇ206Ｃ402);黑龙江省中医管理局资助(ＺＨＹ06-Ｚ47)作者简介:梁颖(1978-),女,硕士,讲师,主要从事中药药理及中药抗突变的研究。
通讯作者:＊吴勃岩(1958-),女,硕士生导师,教授,主要从事中药药理及中药抗突变研究。
收稿日期:2008-03-01修回日期:2008-04-10 胆石症是胆系组织内出现了类似石头或泥沙样的物质,致使胆系管道梗阻、感染而出现一系列临床症状和体征的病症。
胆结石是临床多发病、常见病,包括胆囊、胆总管、肝内胆管结石,在最常见的急腹症中居第二位,是严重影响人类身体健康的疾病。
胆结石包括胆固醇结石和胆色素结石与混合性结石三种。
胆色素结石和胆固醇结石的色素核心中存在较多的单结合胆红素(ＭＣＢ),而脂溶性的ＭＣＢ有较强的促成核作用,可能是结石形成早期的一个促发因素[1]。
机体可以将单结合胆红素转变成结合胆红素,使之排出体外。
在这一过程中胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Ｂ-ＵＧＴ)起关键性作用。
因此,肝脏中Ｂ-ＵＧＴ活性降低及其基因表达下降可能影响胆红素的葡萄糖醛酸化,使胆汁中ＭＣＢ增多,从而诱发胆结石。
1 材料和方法1.1 实验动物 健康雄性Ｃ57ＢＬ/6Ｊ小鼠30只,(18±2)ｇ,由哈尔滨医科大学附属第三医院实验动物室提供。
1.2 主要实验药物、试剂与仪器1.2.1 实验药物与试剂 利胆排石汤:由金钱草、鸡内金、海金沙、滑石、葶苈子、黑芝麻、威灵仙、柴胡、白芍、川楝子、白术、茯苓等药物组成。
以上药物水煎煮2遍,制成每毫升内含生药2ｇ的汤药备用,药物由黑龙江中医药大学提供。
胆红素,ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｅＡＧＣＨ-9470Ｂｕｃｈｓ,批号:293945/1493。
ＵＤＰＧＡ,Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ,批号:449030/131104156。
邻氨基苯甲酸乙酯,Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ,批号:242977-100ＧＢａｔｃｈ#:07615ＴＤ。
1-乙酸正丁酯,天津市光复精细化工研究所,批号:20060415。
考马斯亮蓝,Ｓａｎｌａｎｄ-ｃｈｅｍＩｎ-ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ.,批号:Ｔ2380。
Ｔｒｉｓ,Ｇｅｎｅｂａｓｅ,ＧＢ002。
顺丁烯二酸,天津市光复精细化工研究所,批号:20050801。
氨基磺酸铵,天津市光复精细化工研究所,批号:060822。
总胆固醇试剂盒,长春汇力生物技术有限公司,2006027。
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒,北京北化康泰临床试剂有限公司。
批号:060524。
1.2.2 仪器 ＤＹ89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机,722型可见分光光度计,ＬＤＺ-0.8自动平衡微型离心机,ＤＰＸ-9162Ｂ-1电热恒温培养箱。
1.3 动物分组 小鼠随机分三组(空白对照组、模型对照组和实验组),每组10只。
模型对照组、实验组小鼠给予致石饲料[2](基础饲料中添加15%脂肪,1.25%胆固醇,0.5%胆酸),饮水不限,空白对照组给予正常饲料。
实验组小鼠每天8:00给于利胆排石汤灌胃,剂量为40ｇ·ｋｇ-1,每日1次;模型对照组和空白对照组给予等体积的蒸馏水。
喂养8周后,采集数据。
·77· 2008年第25卷第6期Ｖｏｌ.25,Ｎｏ.6,2008 中 医 药 信 息ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ1.4 小鼠血脂的测定 摘眼球取血,3000ｒｐｍ离心20ｍｉｎ,提取上清液分离血清。
严格按照试剂盒说明书测定血清中的总胆固醇(ＴＣ)及高密度脂蛋白胆固醇(ＨＤＬ-Ｃ)的含量,二者的差值为非ＨＤＬ-Ｃ。
1.5 小鼠胆结石的处理 处死小鼠后,快速取出胆囊,透过胆囊壁或剖开胆囊后用肉眼观察,发现胆囊壁或胆汁中有明显黄色颗粒者,定为有结石形成。
收集胆石,干燥后置于磨口试管中,用二甲基甲酰胺、二甲基亚砜(80:20Ｖ/Ｖ)200μｌ溶解。
严格按照试剂盒说明书测定其中总胆固醇沉淀量。
1.6 肝组织Ｂ-ＵＧＴ活性测定 造模8周后,脱颈椎处死小鼠,快速取出肝组织,制成10%的肝匀浆。
取肝组织匀浆125μｌ,加入暗环境下现配制成胆红素白蛋白100μｌ,混合均匀,37℃保温10ｍｉｎ,加入20ｍＭ的ＵＤＰＧＡ75μｌ,37℃准确保温30ｍｉｎ,以上反应均在暗环境下进行。
再加入1ｍｌ预冷的甘氨酸-盐酸缓冲液终止酶促反应,迅速混匀并放在冰中5ｍｉｎ。
然后加入0.5ｍｌ偶氮试剂提取偶氮化合物,20℃保温30ｍｉｎ。
然后加入10ｇ·Ｌ-1的抗坏血酸0.25ｍｌ终止偶氮反应,混匀后加入2ｍｌ偶氮色素提取液,提取偶氮化的胆红素葡萄糖醛酸(结合胆红素)。
用力振荡混合液,并以4000ｒｐｍ的速度离心10ｍｉｎ。
取上清液,530ｎｍ处测定吸光度[3]。
蛋白质定量用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。
Ｂ-ＵＧＴ活性以每毫克蛋白每分钟所生成产物的摩尔数表示。
偶氮化的胆红素葡萄糖醛酸的消光系数为44.4×103ｃｍ2·ｍｏｌ-1。
1.7 统计学处理 所有数据以均数±标准差表示,采用ＳＰＳＳ10.0软件进行相关回归分析、方差齐性检验和ｔ检验,Ｐ<0.05为有显著性差异。
2 实验结果2.1 小鼠血脂含量 模型对照组的ＴＣ及非ＨＤＬ-Ｃ血清浓度显著高于空白对照组(Ｐ<0.001),利胆排石汤组的ＴＣ及非ＨＤＬ-Ｃ血清浓度与模型对照组比较无明显差别(Ｐ>0.05)。
结果见表1。
表1 血清中ＴＣ、ＨＤＬ-Ｃ、非ＨＤＬ-Ｃ的含量比较(ｘ±ｓ)(ｍｍｏｌ·Ｌ-1)组别例数ＴＣＨＤＬ-Ｃ非ＨＤＬ-Ｃ空白对照组模型对照组利胆排石汤组1010102.8±0.85.9±1.9＊＊＊4.8±1.41.7±0.51.5±0.61.6±0.71.1±0.54.3±1.3＊＊＊1.3±0.9 注:经ｔ检验,利胆排石汤组与模型对照组比较,Ｐ>0.05;与空白对照组比较,＊＊＊Ｐ<0.001。
2.2 胆结石中胆固醇沉淀量 空白对照组小鼠均无胆结石形成,模型对照组结石形成率100%(10/10),利胆排石汤组结石形成率100%(10/10)。
结石呈多发、细颗粒状,淡黄色。
光学显微镜下可见胆固醇结晶。
两组胆结石形成率没有差异,但利胆排石汤组结石颗粒较模型对照组少。
模型对照组胆石胆固醇沉淀量为(9.0±2.6)ｍｍｏｌ·Ｌ-1,利胆排石汤组为(5.5±2.5)ｍｍｏｌ·Ｌ-1,二者相比差异有显著性意义(Ｐ< 0.05),利胆排石汤能明显降低胆结石中胆固醇的沉淀量。
2.3 Ｂ-ＵＧＴ活性 模型对照组小鼠肝组织中Ｂ-ＵＧＴ的活性为(1.28±0.66)ｎｍｏｌ·(ｇ·ｍｉｎ)-1,与空白对照组(3.75±0.68)ｎｍｏｌ·(ｇ·ｍｉｎ)-1比较差异极其显著(Ｐ<0.001);利胆排石汤组小鼠肝组织中Ｂ-ＵＧＴ的活性(1.93±0.65)ｎｍｏｌ·(ｇ·ｍｉｎ)-1明显高于模型对照组(Ｐ<0.05),但显著低于空白对照组(Ｐ<0.001)。
3 讨论血清ＴＣ与胆汁胆固醇呈正相关,当血清ＴＣ> 4ｍｍｏｌ·Ｌ-1时,胆囊中的胆汁已处于胆固醇超饱和状态,在有游离胆红素(ＵＣＢ)作为核心的情况下,容易形成胆固醇结石。
实验结果显示:模型组和利胆排石汤组血清ＴＣ都超过了4ｍｍｏｌ·Ｌ-1,也就是说两组胆汁中的胆固醇都已处于超饱和状态。
模型组血清ＴＣ、非ＨＤＬ-Ｃ显著高于空白对照组(Ｐ<0.001)。
但与模型组比较,利胆排石汤组对血清ＴＣ、非ＨＤＬ-Ｃ的降低效果不显著(Ｐ>0.05)。
尽管模型组和利胆排石汤组小鼠都100%形成了结石,但是两组小鼠的结石量有所不同,模型组小鼠胆囊内的结石明显多于利胆排石汤组。
由于形成结石量少,难以准确称量结石的重量,我们用等体积的二甲基甲酰胺、二甲基亚砜混合液溶解结石,测定溶液中胆固醇的浓度,间接表示胆结石中胆固醇的沉淀量。
结石中胆固醇的沉淀量也是脂类代谢异常在胆囊中的表现。
实验结果表明,利胆排石汤组结石中胆固醇的沉淀量低于模型组,两组比较差异有显著性意义(Ｐ<0.05)。
说明利胆排石汤虽未能完全抑制结石的形成,但能明显降低结石中胆固醇的沉淀量,在一定程度上抑制了结石的生长。
从实验结果推测,利胆排石汤抑制胆结石并不是通过全身降脂实现的。
其是否通过影响ＬＤＬ-Ｃ受体的功能而抑制胆固醇由血经肝分泌入胆囊有待于进一步研究。
血中胆红素以“胆红素-白蛋白”的形式运送到肝脏,被肝细胞摄取,并与肝细胞内的载体蛋白特异性结合,从而从白蛋白分子上脱离,被转运到肝细胞内。
肝细胞中的Ｂ-ＵＧＴ催化ＵＣＢ和ＵＤＰＧＡ生成葡萄糖醛酸胆红素(胆红素葡萄糖醛酸酯),即结合胆红素(ＣＢ)。
ＣＢ较ＵＣＢ水溶性更强,易通过肾小球从尿排出。
如果Ｂ-ＵＧＴ活性减弱,导致产物ＣＢ含量下降,底物ＵＣＢ含量上升,ＵＣＢ除了有水不溶性外,还有胆结石的促成核作用,在胆固醇过饱和的状态下促使胆·78·中 医 药 信 息ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ2008年第25卷第6期Ｖｏｌ.25,Ｎｏ.6,2008结石形成。
实验结果显示:胆固醇结石模型动物中,肝组织Ｂ-ＵＧＴ活性明显低于空白对照组(Ｐ<0.001),可能是致石饮食中的某些因素干扰了Ｂ-ＵＧＴ的活性,影响胆红素的葡萄糖醛酸化,促进了结石的生成。