避免用含卤素离子的缓冲液（如：碘化锂、氯化 钾等） 选用适宜的容器 —玻璃容器必须使用超纯水清洗
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
色谱柱安装及连接的机械因素
连接适当
连接不妥，造成漏液
连接不妥
谱带展宽
色谱泵
色谱泵运行

注意∶


排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如∶进样器、色谱柱 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯 甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中
色谱泵
— 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
紫外检测器
保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗；
使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内； 检测器灯有一定寿命，超过4小时不用时可以不开灯； 尽量避免使用pH>9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英 窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞。
HPLC常见故障分析
干灌注和湿灌注
按主机上的“Menu/Status” 键，进入Status界面。检查真 空脱气机degasser的模式mode 是否为on。（一般为on）
当溶剂的管子是空的时候，或 不小心走干溶剂的时候执行干 灌注 (Dry Prime) 当需要排除气泡时，或平时更 换流动相时执行湿灌注 (Wet Prime) 。
供电电源的影响
泵不良 – 检修泵
HPLC流路基线噪音问题分析
基线有无规律的尖峰
气泡 - 溶剂脱气 电路接触不良 - 保证清洁, 接线牢固, 接点无氧化 光源灯不良- 检查处理 电噪声 - 去除噪声源
—检测器流动池漏
—色谱柱污染
HPLC流路基线噪音问题分析
基线漂移
色谱柱有其他组份被洗脱出 - 冲洗, 直至基线稳定
溶剂发生变化 (如溶入气体或溶剂挥发) - 氦气或脱气机脱气, 溶剂瓶避光,密封(但要注意防止溶剂瓶内产生负压)
系统有漏液之处 - 检漏并处理
环境温度影响 (尤其对示差,电导,电化学检测) - 室温,柱温,检 测池温度控制 环境湿度影响 对光检测器有较大影响

流动相更换
用水更换色谱系统中缓冲液，将吸滤头部分放入 烧杯中边振动边清洗，并用水进行灌注，将管路 中的旧流动相替换，然后插入新的流动相中。
用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂
更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互 溶，要用一种中间溶剂过渡（正反相系统变换时 一般用异丙醇过渡）
Waters溶剂瓶注意事项
源开关至 ON 的位置，仪器开 始进行自检。
2. 仪器将进行大约5分钟的自检过
程，待仪器自我测试完毕后，
画面上方的状态显示区会出现
“Idle” 状态，表示开机测试正 常。
色谱柱对流动相的要求
除去微粒 使用0.45μm或更细的膜过滤 酸碱性较强的流动相应注意对滤膜的腐蚀作用

纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内（一般为pH2-8） 缓冲液（盐）的浓度(≤100mM) 有机溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量
在线状态时，流速不要超过5ml/min） 3. 重复上述的步骤直到对所有溶剂的Wet Prime执行完毕。
注意事项：若有缓冲盐流动相,灌注前用后均需用水过渡
冲洗进样器 Biblioteka Purge Injector)何时执行？
○ 改变溶剂时。
○ 发现注射器及其管路内有气泡时。
○ 每天开机和关机的时候。
1.按“Direct Function” 键，选择Purge Injector，按Enter。
加热

简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组 成的变化 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 简单，但效果一般。超声时间不要太长(1分钟左右即可) 可保持连续脱气，多用于低压梯度 可保持连续脱气，多用于低压梯度
抽真空

超声波

通惰性气体（一般用氦气）

在线脱气机
仪器
*泵 *进样器 *检测器 *数据处理单元
HPLC系统压力问题分析
问题:系统压力高 可能的原因:
—温度太低 —流速太高 —流动相粘度大 —管路堵塞 —仪器或色谱柱堵塞 —压力传感器问题
HPLC系统压力问题分析
问题:压力低或没有压力 可能原因: —温度太高;流速太低 —泵关闭或保险丝断了 —泵未输送流动相 —系统内有渗漏处 —所用溶剂不正确 —自动进样器在Purge时卡住
吸滤头
在线过滤器
单向阀
HPLC系统压力问题分析
单向阀的清洗如果使用过缓冲盐溶液请使用40 ℃
~50℃的温水超声20min 如果使用过纯乙腈请使用异丙醇超声20min 如果使用过其他流动相或上述两种溶液超声后请使用
纯甲醇超声20min
HPLC流路基线噪音问题分析
基线不稳定(不重复)
—检测池中有大的气泡 —流路中有小气泡流过 —系统未稳定或未达到化学平衡 —流动相被污染
1星期
1天
新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
流动相的脱气目的
— 使色谱泵的输液准确
o 输液量均匀准确，并且脉动减小 o 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
— 提高检测的性能
o 防止气泡引起的尖峰 o 基线稳定，信噪比增加 o 溶剂的紫外吸收本底降低
— 保护色谱柱
o 减少死体积 o 防止填料的氧化
流动相脱气的方法
液相色谱对流动相的要求
必须用色谱纯有机溶剂 — 室温下密封,避光保存 水或缓冲盐溶液要用超纯水(18.2MΩ) 缓冲盐流动相: — 当日现配现用 — 低温下密封保存,一般不超过3天 — 最好加5%有机溶剂混合保存
液相色谱对流动相的要求
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: — 低温密封保存 — 防止有机相的挥发
检查6根管子是否在液面下，必须确保6根管子全部
插到溶剂瓶的底部 溶剂瓶液面必须高于溶剂混合阀的位置；而洗针液
的溶剂瓶应放于试验台面上，与2695仪器底部位
于同一水平面上
灌注柱塞密封清洗
1. 主界面中，选择Diag。 2. 按Prime Seal Wash ，再按Start 3. 直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗
干灌注 (Dry Prime)
1.将空的针筒插入抽液阀（排液阀）中，打开抽液阀(以逆时针的方向将 抽液阀旋2-3圈)。 2.按“Menu/Status” 键，进入Status (1)画面，按“Direct Function” 功能 键，选择Dry Prime，按Enter。 3.按下欲使用的溶剂开启阀门(例如:Open A)，然后将针筒向外拉，抽出 约5~10mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡，完成后关闭排液阀。排液 阀不要拧太紧，以不漏液为准。
使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高,要适当 调整压力,一般压力上限在3500-4000Psi 注意防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧 坏电机。
液相色谱系统的清洗与钝化
色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染, 应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂 先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢
反压变化 - 溶剂和样品过滤. 注意黏度过大的样品
HPLC流路基线噪音问题分析
基线周期性噪声
绝大多数情况下是来源于泵的问题 泵头内有气泡 - 流动相脱气 ,泵头排气 泵进出口阀有问题 - 更换单向阀组件 柱塞杆有问题 - 更换柱塞杆及其密封圈 溶剂混合不良 - 加装混合器 电噪声 - 去除噪声源
HPLC流路基线噪音问题分析
HPLC系统压力问题分析
问题:压力低或没有压力 可能原因:（续） —储液瓶中无溶剂 —低压限设置不当 —泵未正确排气 —溶剂入口过滤头堵 —入口管路中有空气 —泵失效
HPLC系统压力问题分析
问题:压力不稳 可能原因: —压力传感器问题 —泵排气不充分 —泵失效 —流动相未正确脱气 —所用溶剂不混溶或易挥发
2.输入Sample Loop 体积清洗的倍数(原定值为6 倍)，按Enter。
冲洗进样器
每次进样前仪器会洗针（Needles wash）进样之
后不洗针 进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗 每次批量进完样后手动清洗
或最后进一针50μl流动相
如果流动相中有盐的话则用水替代缓冲盐那部分比例
色谱泵及系统的钝化
钝化液用6M硝酸水溶液
6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀
钝化步骤如下:
— 在清洗步骤完成后进行钝化处理 — 确认清洗用的磷酸已基本洗净
— 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)
— 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 — 换成清水洗至出口水pH显中性
废液管，按Halt。
4. 按Close。
密封圈清洗的溶液，在反相液相色谱中 可使用90％水/10％甲醇 (体积比，根据 实际需要进行选择)。
灌注针头清洗
1. 主界面中，选择Diag。 2. 按Prime Ndl Wash，缺省设定值 为30 秒，若想要多清洗几次时，
请按Start Again。
洗针溶液，在反相液相色谱中可使 用50％水/50％甲醇 (体积比，根据实 际需要进行选择)。
钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜
色谱泵及系统的清洗
清洗液用30%磷酸水溶液
30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀