PNS载体
完全基因敲除
（Complete Knockout）
1 2 neo IREs lac Z
3
tk
靶基因 中靶等位基因
1
2
3
G418, GANC
1 2 neo IREs lac Z
3
Lim1 is Required for Head-organizer Function
Shawlot W & Behringer RR: Nature, 1995, 374:425
Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation. Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the protein.
克隆和转化
1
2
3
4
5
6
7
利用RACE-PCR获得全长cDNA克隆
5‘ RACE-PCR 5‘
5‘
5‘ 3‘AAAA
AAAAAA……An 3’ RT with internal Antisense primer
AAAAAA……An 3’ terminal transferase and dATP
AAAAAA……An 3’ denature, anneal anchor primer and extend
Use PCR to amplify specific DNA sequences to see if they were precipitated with the antibody.
利用转基因和基因打靶技术 在生物整体水平上研究基因在 发育和疾病发生过程中的功能及其机制
模式生物的概念
A model organism is a species that is extensively
reporter gene
染色质免疫沉淀（ChIP）用于筛选在体内 与特定蛋白质相互作用的DNA序列
DNA-binding proteins are crosslinked to DNA with formaldehyde in vivo.
Isolate the chromatin. Shear DNA along with bound proteins into small fragments.
原位杂交
lim 1
E8.5
利用转基因动物 研究基因表达 的时空模式
Tie2 P lacZ polyA
利用转基因动物研究miRNA 表达的时空模式
Mansfield et al: Nature Genetics, 2004, 36:1079
利用cDNA array进行基因表达差异分析
+/+
HBsAg/HBsAg
模式生物的应用已有 100多年的历史，在生物学研究中具有不可 替代的重要作用。大多数生物学过程在长期的进化过程中是高度 保守的，因此，许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都 是类似的，模式生物也因此成为研究人类生物学过程和疾病发生 的重要工具。
模式生物的基本特征
发育迅速、世代周期短，利用这些模式生物很 容易在相对较短的时间内研究基因在许多世代 间的遗传 。 成年动物个体小。 繁育能力强，后代数量大，易于在实验室条件 下维持。 可操作性强。
TTTTTT AAAAAAAA
denature, anneal internal primer and extend
TTTTTT AAAAAA
PCR with internal and Anchor primers
5‘
TTTTTT
3‘
3‘
AAAAAA
5‘
TTTTTT 3‘AAAAAA
基因结构和转录起始位点研究
without Nuclear extract
with Nuclear extract
利用培养细胞在蛋白质水平研究 基因的表达和功能
利用抗体检测基因的表达模式。 蛋白质工程是研究基因功能的有效手段。 利用免疫共沉淀、噬菌体表面呈现技术、 酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质间的 相互作用。 利用染色质免疫沉淀研究蛋白质与DNA 的相互作用。 蛋白质组学研究。
利用无启动子报告基因表达载体 鉴定基因的调控序列
1
2 3
P
4
reporter pA
连接并转染特定细胞
reporter pA
reporter pA
P reporter pA
检测报告基因的活性
reporter pA
利用DNase I 足迹分析研究DNA上 的蛋白质结合位点
Partial DNase I
在体细胞中实现基因敲除
( Gene Knockout in Somatic Cells )
Lasker Fundation Press release
基因打靶（gene targeting）：在基因组水平上定位改变细胞或生物 个体基因结构的实验技术。 条件基因打靶（conditional gene targeting）：通过同源重组和位点 特异性重组技术在特定细胞类型或者特定发育阶段对基因进行定位 修饰的实验技术。 基因敲除（gene knockout）：又称基因剔除。通过同源重组或位点 特异性重组在基因组水平上改变特定基因结构， 使其功能完全丧失 的实验技术。 条件基因敲除（conditional gene knockout）：又称“条件基因剔除”。 通过同源重组技术和位点特异性重组在特定细胞类型或者特定发育 阶段使基因功能完全丧失的实验技术。 组织特异性基因敲除（tissue specific gene knockout）：又称“组织 特异性基因剔除”。 在特定组织细胞类型中使基因功能完全丧失的 实验技术。 基因敲入（gene knockin）： 通过同源重组或位点特异性重组在基 因组特定位置引入外源基因的实验技术。
利用培养细胞在核酸水平研究 基因的表达和调控
利用Northern杂交、原位杂交、RT-PCR、 mRNA表达差异显示技术研究基因的表达 模式。 利用报告基因和缺失突变分析鉴定基因的 调控序列。 用 Gel retardation、DNase 足迹分析研究 DNA上的蛋白质结合位点。
Northern-blot
基因功能研究与相关技术
滕艳
生物工程研究所 发育和疾病遗传学研究室
结构基因组学 功能基因组学
基因组分析的初级阶段，主 要任务是系统产生及分析基 因及基因组结构信息。
以DNA序列测定为主要手段。
以获得高精度的遗传图谱、 物理图谱、转录图谱为最终 目的。
生物信息学侧重于数据组织 和管理。
基因组分析的新阶段，主 要任务是系统产生及分析 基因功能相关的信息。
A
5.0 kb
1
2
3
4
B
1 2 3 4 5 67 8
5.0 kb 4.4 kb
Smad3基因在小鼠不同胚胎期及成体各组织器官中的表达。 A、Northern杂交结果显示Smad3基因在小鼠胚胎期 E7(lane 1)、E11(lane 2)、E15(lane 3)、E17(lane 4)表达。B、 Northern杂交显示Smad3基因表达在小鼠各成体组织器官。 1、睾丸；2、肾脏；3、骨骼肌；4、肝脏；5、肺；6、脾 脏；7、脑；8、心脏
基因打靶技术—源于1987年
基因打靶是一种改变细胞或者生物个体基因 结构的体内诱变方法，是在胚胎干细胞技术和同 源重组技术基础之上发展起来的。
Lasker Award 2001
Mario Capecchi
Martin Evans
Oliver Smithies
“…… Capecchi, Evans and Smithies have revolutionized the study of human health and diseases.”
studied to understand particular biological phenomena, with the expectation that discoveries made in the model organism will provide insight into the workings of other organisms.
基因打靶技术的基本流程
中靶ES细胞经显微 注射引入受体囊胚
体外对ES 细胞遗传 物质进行定向修饰
携带中靶ES的囊胚 经胚胎移植引入假 孕鼠子宫
种系嵌合体的鉴定 以及基因打靶小鼠 的表型分析
基因打靶的策略
基因敲除（ES细胞，体细胞） 精细突变的引入 染色体组大片段的删除 基因敲除的时空调控 大规模随机基因敲除-基因诱捕 大规模随机诱变研究-ENU诱导的点突变 在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶
用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验确定 基因转录起始位点 确定外显子和内含子结构图谱 生物信息学研究基因结构、功能和进化
用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验 确定基因转录起始位点
5‘ 3‘
-32P(•)
3‘ 5‘
3‘ 5‘
3‘ 5‘ Ploynucleotide kinase
Hybridize with total RNA 5‘ AAAAA 3’
小鼠是研究哺乳动物的主要模式生物
具有较短世代周期的 哺乳动物。 组织细胞的结构和功 能与人类相似。
全基因组序列已被 测定。
小鼠基因组规模（2.5 Gb）及基因排列次序 与人类（2.9 Gb）相似。
利用转基因技术和 基因打靶技术可对 小鼠遗传物质进行 活体修饰。
拥有众多近交系。 繁育能力强。
Producing Transgenic Mice by Micro PBS