将含有青霉素合成基因的DNA片段转入其它宿 主，宿主获得合成青霉素的能力

根据大量的实验结论，目前认为青霉素合成基 因的调控靠一些全局调控因子完成
已发现的全局调控因子

LaeA
Velvet复合物 PcRFX1


基因工程育种
育种历史

Fleming：2U/ml 产黄青霉NRRL1951:100U/ml


进展


1,3-diaminopropane和spermidine可以促进青 霉素合成基因的表达。其机制是促进laeA基因 的表达，由其合成的laeA介导激活青霉素合成 基因
penT通过促进苯乙酸和苯氧乙酸这两种前体物 质的跨膜运输来提高青霉素的产量


大肠杆菌青霉素结合蛋白PBP5：结合青霉素后 打开β-内酰胺环，令其丧失功能
4.将该阅读框构建入载体并转换大肠杆菌。实验 发现，含有该阅读框的大肠杆菌的培养液表现 出IPNS活性。对含有该阅读框的大肠杆菌培养 液进行SDS-PAGE，发现了与IPNS迁移率相同 的蛋白质

SDS-PAGE结果

该阅读框编码的蛋白质为IPNS。用此方法获得 pcbC 随后，pcbAB、penDE相继被克隆

先看看S. M. Samson, R. Belagaje, D. T. Blankenship, J. L. Chapman, D. Perry, P. L. Skatrud, R. M. Van Frank, E. P. Abraham, J. E. Baldwin, S. W. Queener等人的实验
把这种融合酶至于体外反应器，可不可以直接以α-氨 基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸为原料合成青霉素呢？ 这样的理论转化率可以达到100%

青霉素合成基因
回顾历史

1928年，弗莱明发现点青霉抑制金黄色葡萄球 菌生长的现象。 1940年弗洛里、钱恩完成青 霉素结晶

美国制药企业于1942年开始对青霉素进行大批量生产。到了 1943年，制药公司已经发现了批量生产青霉素的方法。当时英 国和美国正在和纳粹德国交战。这种新的药物对控制伤口感染非 常有效。到1944年，药物的供应已经足够治疗第二次世界大战
设想

IPNS和AT的基因相邻，因此将这两种酶制成融合酶具 有空间上的优势。如果制成这种融合酶，那会不会使 效价更高呢？

如果让pcbAB倒位，然后通过点突变让三个基因位于同 一个转录单元，并转录出只含一个ORF的mRNA，那么 该mRNA的翻译产物是不是ACVS、IPNS和AT的融合酶 呢？这种融合酶会不会使青霉素得率更高呢？
经典实验：pcbC的克隆
1.对IPNS进行N端测序
2.根据测序结果设计探针（下划线）
测序结果
3.构建顶头孢霉菌（Cephalosp。对阳性克隆测序。

在获得的序列中发现了一个编码分子量38416 的多肽的开放阅读框。该多肽的分子量与SDSPAGE测得的IPNS分子量接近（40000）


传统的育种随机性大。人们期待理性设计。这 必须求助于青霉素合成的基因

1991年，首次开始青霉素的基因工程育种

目前青霉素发酵的效价可达到85000U/ml
基因工程育种策略
1.增加基因拷贝数
（1）通过增加产黄青霉Wis 54-1255的pcbC和penDE的 拷贝数，该菌株青霉素产量提高40% （2）扩增整个青霉素合成基因簇，可使产率提高176% （3）扩增3个pcbAB、1个pcbC、2个penDE可是产率与 摇瓶相比提高299%
期间所有参战的盟军士兵

多罗西· 霍奇金通过x射线衍射，提出青霉素分 子结构
背景介绍
1.青霉素产生菌种
点青霉(Penicillum
nototum)
产黄青霉(Penicillum
chrysogenum) nidulans)
构巢曲霉(Aspergillus ……
2.青霉素合成途径
3.研究表明，IPNS为关键酶
青霉素合成基因

在产黄青霉和构巢曲霉中，青霉素的合成由三 个基因控制。它们分别是pcbAB、pcbC和 pcbDE。这三个基因位于同一条染色体上
青霉素合成基因的结构
基因表达的产物

pcbAB：ACV合成酶
pcbC：IPN合成酶 penDE：IPN酰基转移酶（AT）


基因的克隆------以顶头孢霉菌pcbC为例

基因表达的调控

青霉素合成基因的表达受碳源、氮源、pH等因 素的调控
影响基因表达的调控的因素

碳源:研究发现，葡萄糖对青霉素的发酵有抑制 作用。故工业上采用补料添加葡萄糖等方式解 除抑制
氮源：高浓度铵离子对产黄青霉（P. chrysogenum） 发酵青霉素有抑制作用 pH：当pH为8.1时，构巢曲霉（A. nidulans） 产青霉素效价高


对葡萄糖效应的解释

代谢角度：抑制LLD-ACV的合成
化学角度：青霉素和葡萄糖发生反应？ 基因角度：pcbAB、pcbC、penD的转录受葡萄 糖的阻遏


对pH和氮源影响青霉素代谢的解释

pH通过转录调控因子PACC的介导调控青霉素 合成

铵离子直接影响青霉素合成基因的表达
调控机理
一些实验结论： 含有青霉素合成基因的DNA区段未见合成调控 因子的区域
2.增强酶的表达量
用乙醇脱氢酶的启动子取代ACVS的天然启动子可以使其 表达量增加
青霉素合成的基因小结

pcbAB、pcbC、penDE分别编码青霉素合成三 部曲对应的三个酶。其中pcbC编码的IPSN为关 键酶。
青霉素合成基因受全局调控因子调控。如LaeA、 Velvet复合物、 PcRFX1 增加基因拷贝数和酶的表达实现基因工程育种