pET表达系统的原理
pET表达系统的原理
使用乳糖或乳糖类似物进行诱导表达，表 达的时机完全由人为决定，可控性强。
可控制的 表达
强大、灵活的 pET表达系统
低本底的 表达
非诱导培养条件下，采用一 定的措施可以使目的基因完 全处于沉默状态而不转录。
高效率的 表达
充分诱导时，几乎所有的细 胞资源都用于表达目的蛋白 ；诱导表达后仅几个小时， 目的蛋白通常可以占到细胞 总蛋白的50%以上。
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内容介绍
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乳糖操纵子的正负调控 T7 RNA 聚合酶 pET表达系统
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乳糖操纵子的结构
I
operator P O
lac operon
Z
Y
A
Lac I 阻遏蛋白
β-半乳糖苷酶
Lac 通透酶
Lac 乙酰转移酶
lacUV5
与cAMP-CAP复合体的亲 和能力大大降低
lac
lacUV5
在没有cAMP-CAP复合体 的情况下能更好的转录
只受lacI阻遏蛋白调控
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T7 RNA聚合酶
来源
• λ(DE3)噬菌体，单链蛋白。
专一性 转录效率
• 只识别λ噬菌体启动子，不识别大肠杆菌启动子。
cAMP水平过高，从而刺激 lacUV5启 动子指导T7 RNA聚合酶的转录。
本底表达
培养基
培养基中存在乳糖。
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Thank You!
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• 噬菌体启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别。
• RNA的合成速度是大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍
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pET系统表达原理
未诱导的情况下
E.Coli 基因组
lacUV5 T7 RNA Polymerase gene
目标基因 lacI 阻遏蛋白 T7 启动子 pET
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乳糖操纵子的负调控
诱导物不存在时 I
I mRNA I mRNA翻译出的阻遏蛋白结合到启动子部位， 阻止lac 操纵子基因的转录
P
O
Z
Y
A
诱导物存在时 I
I mRNA
P
诱导物
O
lac
诱导物与阻遏蛋白结合使阻遏蛋白无法与启动子结 合，转录顺利进行，表达相应的酶
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乳糖操纵子的正调控
cAMP CAP
在细菌饥饿时，胞内的cAMP浓度会上升，与CAP 结合促使后者活化。蛋白复合体可以结合到lac启 动子区域，提高启动子的转录效率。
I
P
诱导物
O
lac mRNA
Z
Y
A
诱导物
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pET系统表达原理
诱导的情况下
E.Coli 基因组
lacUV5 T7 RNA Polymerase gene
目标基因
lacI 阻遏蛋白
pET
乳糖或IPTG
T7 启动子
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pET系统的本底表达
cAMP过高