细菌的常用染色技术
简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
例如番红。
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥
7．镜检
复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。
例如革兰氏染色法。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。
1.载玻片固定。
在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2.草酸铵结晶紫染1分钟。
3.自来水冲洗，去掉浮色。
4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。
5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。
6.用番红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。
细菌的染色及形态观察
一、目的要求
1、了解细菌染色的基本原理。
2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。
3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。
二、实验说明
细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。
由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。
用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。
发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。
染色剂有三种：酸性染色剂（电离后分子带负电荷）；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。
酸性染色剂主要用于染细胞质；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。
三、实验材料
1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2、酒精灯、接种环、载玻片。
3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录）。
四、方法步骤
（一）简单染色法
步骤：涂片→ 干燥→ 固定→ 染色→ 水洗→ 干燥
镜检。
1、涂片在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种，在载玻片上和水混合后，涂成一均匀薄层。
2、干燥固定涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。
3、固定待涂片干燥徨，手持载玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料。
4、染色玻片置于水平位置。
加石炭酸复红液于菌膜部位。
染1-2min。
5、水洗倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗（切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸吸干。
7、镜检。
（二）革兰氏染色法
步骤：涂片→ 干燥→ 固定→ 结晶紫染色→ 水洗→ 吸干→ 95%酒精脱色→ 水洗→ 吸干→ 蕃红复染→ 水洗→ 干燥→ 镜检。
1、涂片同简单染色法
2、干燥同简单染色法。
3、固定同简单染色法。
4、用草酸结晶紫染色1min后水洗。
5、加碘液媒染1min。
6、水洗。
7、用95%酒精脱色，直至流下的酒精不呈紫色即停止（大约半分钟）立即水洗。
８、复染滴加蕃红染液复染1min。
９、水洗。
10、干燥。
11、镜检。
（三）特殊染色法
1、芽孢染色法芽孢壁较厚，透性低，着色和脱色均较困难，因此，芽孢染色需加热，并用着色力强的染料。
步骤：涂片→ 固定→ 孔雀绿染色→ 水洗→ 干燥→ 观察。
1、涂片取一载片，将枯草杆菌以无菌操作涂片。
2、干燥同简单染色法。
3、固定同简单染色法。
4、加孔雀绿染液于涂片上，在火焰上加热直至有蒸气时开始计算时间，维持3-5min。
加热时要随时添加染色液，切片让标本干涸。
5、水洗待玻片冷却后，用自来水水洗。
6、复染加蕃红液复染1-2min。
7、水洗干燥。
8、镜检。
结果：芽孢呈绿色，芽孢周围的菌体呈红色。
2、荚膜染色法（用固氮菌或肺炎双球菌）
步骤：
1、在载片一端滴一滴自来水，取菌体置于其中。
取一滴墨法与菌悬液混合，并且用另一载片之一端，将此水滴在载片上刮成薄膜，风干。
2、用纯甲醇固家1min。
3、加0.5%蕃红液数滴于涂片上冲去甲醇，并染色30S，然后倾去染液，立即吸干，镜检。
结果：背景黑色、荚膜无色，细胞红色。
3、鞭毛染色法（用荧光假单细胞或普通变形菌）细菌鞭毛极为纤细，在普通光学显微镜下不能看到，只有用特殊的染色方法，才能把鞭毛显示出来。
鞭毛染色的方法很多，但主要原理都是采取不稳定的胶体溶液做媒染剂，使在鞭毛上生成沉淀，加粗鞭毛的直径使其达到光学显微镜辨晰限度以内。
步骤：
要染色的细菌应预先在新配制的斜面上传5-6代。
最后一代用的斜面部应放约0.5毫升的无菌水再进行接种。
将最后一代长好的菌用细长吸管从底部取出放入1ml无菌水中制成菌悬液。
放37℃温箱活化半小时再取制片。
2、涂片取一无划痕且十分清净无油脂的载片，可先将载片置于洗液中浸渍数日，用镊子取后随即以清水冲洗干净（冲洗时勿用手指取捏玻片），再斜插于木架上，置37℃恒温箱内任其干燥后备用。
取上述菌悬液一滴，轻置玻片一端，玻片作倾斜放置，使菌液沿玻片顺向下流，自成一薄菌膜。
3、干燥让其自然风干。
4、染色先用染液A染2-4min,水冲洗,再用B液染30-60A,立即用水冲。
5、镜检。
结果：菌体的鞭毛呈黑色。