实验一、木瓜蛋白酶活性测定实验(明胶法)(一)实验原理木瓜蛋白酶从明胶中分解出氨基酸和肽，其氨基型氮可用甲醛复分解，产生氢离子，浓度可用氢氧化钠溶液滴定。

(二)定义一个木瓜蛋白酶单位相当于在规定条件下分解1ug分子量的肽键时所需的酶量。

(三)试剂1. 底物明胶2. 柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 取70.000g一水柠檬酸溶于720mL 1mol/L氢氧化钠溶液中。

用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至5.0，用蒸馏水定容至1000mL。

3. 37%甲醛溶液4. 酚酞溶液取0.5g酚酞溶于95%的乙醇中，并定容至50mL。

5. 0.1mol/L氢氧化钠溶液取4.0克氢氧化钠置于洁净干燥的烧杯中，加纯水稀释、搅拌溶解，将溶液移入1000ml洁净容量瓶中定容至刻度。

6. 酶溶液用蒸馏水溶解酶，每毫升配制溶液应含有40U左右。

酶的称量一定得按以下原则确定：用于主值和空白值试验的耗量之差应在1.8～2.2mL这一范围内。

此外需用一个合适的称量重复测定几次。

(四)操作步骤称取500mg明胶放入一只100mL锥形烧瓶内，加8mL蒸馏水，加热后明胶溶解。

待明胶完全溶解加2.0mL柠檬酸盐缓冲液，置于水浴中冷却至40℃。

加5.00mL已预热至40℃的酶溶液，于40℃下保温60min，加10.0mL甲醛溶液终止反应。

加0.5mL酚酞溶液后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，直至第一次出现明显的粉红色为终点。

用同样方法测定空白值，只是这里在添加酶溶液之前先添加甲醛溶液。

在空白值测定方面耗去大约5mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(五)计算用以下公式计算酶活性：酶活力(U/mg)=(H-B)/E W×100式中：H-用于主值的滴定耗量(mL)；B-用于空白值的滴定耗量(mL)；100-相当于1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液；E W-每5.0mL所用酶液中含有酶的重量(mg)。

举例：测定一个木瓜蛋白酶样品。

从样品中称取68.2mg，定容100mL。

5 mL此溶液中含有3.41mg样品。

8.52mL滴定耗于空白值试验，10.57mL耗于主值试验。

则酶活性为：(10.57-8.52)×100/3.41=60.1 U/mg实验二、木瓜蛋白酶在肉类嫩化中的应用动物肉类是人类生活不可缺少的食品。

在肉的全部质量特征中，嫩度是影响其食品质量的重要特征。

决定肉硬度的最主要因素是肌原纤维和结缔组织，而肉的总嫩度基本上是由结缔组织中胶原蛋白含量决定。

通过添加蛋白酶、使肉类胶原蛋白中的肽键和交联发生断裂，破坏蛋白质严密的空间结构，可使肉嫩化。

生产中最常用的是木瓜蛋白酶，它是一种含巯基的内切酶，半酰氨基蛋白酶，具有广谱的水解活性。

主要在烹调过程中起作用。

它能在酸、碱和中性环境下降解肌原纤维和结缔组织的蛋白质，将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成小分子的多肽和氨基酸，令肌丝和筋键断裂，使肉类变嫩。

(一)操作步骤将选取牛肉剔出可视的结缔组织和脂肪，切成3cm×3cm×1cm的小块。

分别用0%、0.002%和0.005%浓度的木瓜蛋白酶溶液浸泡，将肉块在4℃贮存30min。

置于恒温水浴锅内，水温恒定在80 ℃。

当肌肉中心温度达70 ℃时，取出，冷却至室温，用直径为1 cm的空心取样器钻取肉柱(避开筋腱)，用C-LM嫩度仪测定其剪切力值。

每个肉样测定6个重复，取平均值。

实验三、唾液淀粉酶活性测定一、实验目的1．了解淀粉酶对不同底物的专一性； 2．了解温度对酶的影响；3．掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法。

二、实验原理淀粉酶能作用于淀粉中的α-1,4葡萄糖苷键，使淀粉分解为麦芽糖。

反应方程式如下：2（C 6H 10O 5）n + n H 2On C 12H 22O 11但是淀粉酶不能作用于蔗糖分子的α-D 吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃果糖的C2之间的糖苷键。

淀粉的还原性极小，而唾液淀粉酶（主要含α-淀粉酶）水解淀粉后形成的麦芽糖有还原性，使3,5-二硝基水杨酸（DNS 试剂）还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。

本实验以一定量的唾液淀粉酶液，于37℃、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。

在一定范围内，反应液的棕色深浅与还原糖的含量成正比，在波长500nm 处测定溶液的吸光度，根据标准液浓度得吸光度，便可求得样品中还原糖得含量。

三、实验器材1．实验材料：淀粉酶液2．实验试剂：可溶性淀粉、二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、磷酸缓冲液（0.2 mol/L ，pH6.8）、1mg/ml 标准麦芽糖溶液3．实验设备：刻度试管（25mL×10）、洗瓶、试管架、玻棒、水浴锅、分光光度计、滤纸四、试剂的配制淀粉酶1. 淀粉溶液（0.5%）称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。

（临用前配制）2. 蔗糖溶液（1%）称取蔗糖1g，将之溶于蒸馏水后定容至100ml。

3. 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。

再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。

暗处保存备用。

4. 磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.8）A液—0.2mol/L Na2HPO4溶液：称取35.62g Na2HPO4·12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。

B液—0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。

取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成pH6.8缓冲液。

5. NaOH溶液（2N）量取80 ml去离子水置于100~200 ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂)。

称取8 g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌，待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定容至100 ml，将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。

6. 1mg/ml 标准麦芽糖溶液：取100mg 麦芽糖溶于100mL超纯水中。

五、实验步骤1．唾液淀粉酶的制备（1）提取：先用水漱口清洁口腔，然后含1小口（约5 ml）蒸馏水于口中轻漱1~2 min。

（2）过滤：将口腔中的酶提取液用滤纸过滤。

（3）稀释：取滤液1 ml，用水定容至50 ml。

作为淀粉酶的样品。

注意：由于不同人或者同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50~300倍，甚至超过此范围。

2．唾液淀粉酶的专一性实验取25mL刻度试管4支试管，按表1编号并记录所观察到的颜色。

3．唾液淀粉酶活力的测定用5号空白管做对照：在500nm处测定3、6管的吸收值。

将数据填入表1。

4. 计算根据溶液浓度与光吸光值成正比的关系，即：A标准/A酶=c标准/c酶则c（酶液管中麦芽糖浓度）＝（A酶×c酶）/A标准，（其中c为浓度，A为吸光值）本实验规定：在37℃、pH6.8的条件下，每3min水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活单位。

总活力单位＝c酶×n酶（c酶为麦芽糖的浓度；n酶为稀释倍数）六、实验结果记录1．计算酶活。

2．为什么酶促反应要在37℃水浴？沸水浴的目的是什么？3. 本实验验证了酶的哪些特性？附：分光光度计的使用：（1）先了解仪器的各个操作旋钮的功能和电表的读数方法。

（2）开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置使用波长。

打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），预热20min后。

（3）将预先装好空白溶液和待测液的比色杯，依次放入暗箱内的比色皿架上。

◆比色杯中所盛溶液不宜过满，大概2/3体积，若不慎使溶液流出比色杯外面，应用滤纸吸干，再用擦镜纸擦净后才能放入比色杯架内。

◆手不能接触比色杯的光滑面，切忌用滤纸等物擦拭比色杯的光滑面。

（4）打开暗箱盖，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。

盖上暗箱盖，将对照液处于校正位置，使光电管受光，调节透光率“100”旋钮，使数字显为“100.0”。

连续几次调整“00.0”和“100.0”，仪器即可进行测定工作。

◆如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能使用低倍率档，这样仪器有更高的稳定性。

但改变倍率后必须按步骤4重新校正“00.0”和“100.0”。

（5）将选择开置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将待测样品移入光路，现实值即为吸光值。

◆测定时尽量使光吸收值不要超过1。

（6）测定完毕，将每个旋钮、开关和调节器等复原和关闭，拔掉电源插头。

◆用完比色杯后立即用自来水冲洗比色杯，再用蒸馏水洗净，将比色杯倒立晾干；每套仪器所配套的比色皿，不能与其他仪器上的比色皿单个调换。

试剂：明胶、一水柠檬酸、氢氧化钠、蒸馏水、甲醛、酚酞、乙醇、酶、可溶性淀粉、蔗糖、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、Na2HPO4·12H2O、无水柠檬酸、麦芽糖、刻度试管材料：锥形烧瓶、电炉、水浴锅、10mL试管、碱式滴定管、100mL 烧杯、剪刀、1000mL容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶、10mL 移液管、吸耳球、pH计、电子天平、C-LM嫩度仪、冰箱、牛肉、玻棒、水浴锅、分光光度计。