• 检查物理性损坏 • 用标准测试样品在标准条件下测试柱子，以验证柱效 • 每支菲罗门色谱柱都经过单独检测
管路和接头
• 色谱性能取决于整个系统，而不仅仅是色谱柱 • 管路和接头会造成系统的死体积 • 系统死体积会导致:
– 峰展宽 – 峰形差 – 柱效降低 – 灵敏度降低
管路和接头
优化HPLC系统以获得最大性能 • 改变连接管路的内径（id）
350
300
300
0.280 0.467
0.697 0.972 1.275
0.204 0.399
0.650 0.958 1.308
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
0
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25 min
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
• 怎样去做? – 流动相入口过滤头 – 在线过滤器 – 保护柱 – 流动相脱气 – 过滤所有流动相组分 – 过滤所有样品
样品作为污染物的来源
• 样品基质是HPLC/UHPLC柱主要的污染物来源，常 会导致:
• 背压升高 • 色谱性能降低
– 峰形问题（分叉，拖尾） – 柱效降低 – 分辨率降低
样品的制备
接头
聚合物 手紧螺母
32圈螺纹/英寸 10号或0.190’’
锥箍
1/16’’OD管路 （0.010’’ID）
螺母
尖端固定长度 为关键尺寸
10-32 螺母和锥箍
1/4’’OD标准分析柱 （250 x 4.6mm ID）
色谱柱柱头
不同厂商的接头
连接接头
• 如果超出锥箍的管路长 度过长，锥箍将固定不 当，导致漏液
4. 检测器到废液瓶 • 可以使用更大的内径(0.010”)
11
接头
• 并非所有的色谱柱和接头都一样 • 使用锥箍的种类/形状也各有不同 • 固定长度不同 (0.080”到0.130”) • 固定长度很关键
– 管路一定要与色谱柱相匹配 – 不匹配的接头会导致死体积的增大或漏液 • 手紧接头 (聚合物的) – 容易使用 – 一体的 – 符合柱头的形状
其它注意事项
• 背压通常保持在3500 psi以下（常规的HPLC柱和系统） • UHPLC柱具有更高的压力限（≥9000 psi） • 流速必须符合色谱柱的背压限 • 避免突然的压力变化 • 万一背压升高，可以反冲色谱柱（向色谱柱制造商核实
一下）
色谱柱的保护
• 为什么要这么做呢? – 最大限度地延长色谱柱的寿命 – 减少系统损耗 – 从长远来看，可以节约时间和成本 – 获得最佳的结果
微生物在柱头填料 上的生长
其它注意事项
• 保持pH在2.0到8.0之间（旧型硅胶和极性封尾相）或 在1.5到10.0之间（新型硅胶）
• 低pH会使键合相从硅胶上断裂下来（水解） • 高pH会使硅胶溶解 • 如在接近pH极限下运行时，使用预饱和柱将使这些影
响降到最低
• 更新型的介质可以提供更宽的pH稳定性(1 – 12)
– 含有离子对的流动相平衡所需时间更长
流动相
• 使用HPLC级溶剂 • 使用最高纯度的化学药品和试剂 • 使用前脱气和过滤所有流动相 • 保证溶剂是互溶的 • 验证缓冲盐在混合水/有机流动相中的溶解度
（尤其采用从高水相到高有机相的梯度洗脱时） • 检查样品在流动相中的溶解度
流动相
• 强烈建议每天更换水相缓冲溶液，以最大程度的减少 微生物的生长，避免这些微生物堵塞在线过滤器和色 谱柱。
管路和接头
优化前
• 峰宽 – 峰3: 0.072 min – 峰4: 0.085 min – 峰5: 0.103 min
• 分辨率 3/4 = 2.06 • 分辨率 4/5 = 1.89
优化后
• 峰宽 – 峰3: 0.057 min – 峰4: 0.076 min – 峰5: 0.099 min
• 分辨率 3/4 = 2.73 • 分辨率 4/5 = 2.35
优化前
DAБайду номын сангаас1 B, Sig=254,8 Ref=off (F:\PROJECTS\0217_M~1\IN-PRO~1\INSTRU~1\CONFIG07.D) mAU
350
优化后
DAD1 B, Sig=254,4 Ref=off (F:\PROJECTS\0217_M~1\INSTRU~1\CHROMA~1\HPLCSY~1\TESTIN62.D) mAU
2
2.25 min
连接管路
1. 泵到进样器 • 可以使用大一点的内径(0.010” = 0.254 mm)
2. 进样器到色谱柱 • 管路内径最小化 • 通常使用0.007” (0.178 mm)或0.005” (0.127 mm) ID
3. 色谱柱到检测器 • 管路内径最小化 • 大一些的内径会影响分离效果 • 通常使用0.007”或0.005” ID
• 在向HPLC/UHPLC柱进样前，去除潜在的污染物 • 过滤样品(0.45或0.2 µm针式滤头) • 样品净化 – 例如SPE, 蛋白沉淀等
柱头处 – 新柱
柱头处 – 样品前处理不当
HPLC色谱柱的认识和维护
2
3
4
HPLC色谱柱的维护保养
HPLC色谱柱维护保养概要:
• 收到新的色谱柱 • 管路和接头 • 流动相注意事项 • 色谱柱的保护 • 保护柱 • 色谱柱的清洗 • 色谱柱的保存
收到新的色谱柱
• 核实色谱柱的信息 – 是你订购的色谱柱吗? – 规格是否正确? – 固定相是否正确?
• 如果超出锥箍的管路长度 过短，就会造成死体积， 导致峰展宽和拖尾
流动相
• 彻底冲洗HPLC泵和管路以去除气泡（打开冲洗阀来 加速过程）
• 连接色谱柱和进样器 – 检查流向是否与色谱柱标签指示方向一致
• 流动相起始流速为0.1 mL/min，随后逐渐增大到正常 流速
• 停止流速并将色谱柱与检测器入口连接 • 重启流速，用10-30个柱体积的流动相平衡色谱柱
– 0.17 mm id到0.12 mm id • 减小流通池的体积
– 标准流通池 – 13 µL, 10 mm 路径 – 半微量流通池 – 5 µL, 6 mm 路径
条件 • Luna® 3µm C18(2), 10 x 2.0 mm
– (MercuryMS™柱芯) • 50:50 乙腈/水 ，0.2 mL/min • HP1100 w/二元泵