病理组织学诊断检材的制备技术一、组织的固定㈠凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。

固定液量应为被固定标本体积的5~10倍。

置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。

临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。

未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做切片。

㈡常规固定液为4%中性甲醛（10%中性福尔马林），应预先多量配制贮存，以备随时使用。

小标本的固定时间为4~6小时，大标本为18~24小时或更久。

㈢根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色、电镜观察等）的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定［参见后述的“㈦固定液的常用种类和制备”］。

㈣器官、组织固定的基本方法1．食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上（重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入4%中性甲醛中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉）。

2．肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.5~2.0cm纵向平行剖开，切成数片。

将每片肝或脾轻轻地平放于装有4%中性甲醛的容器中，容器底面衬以脱脂棉。

应避免标本弯曲和相互间的叠压。

3．肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。

必要时从支气管注入适量4%中性甲醛。

4．肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面（深达于肾盏），再行固定。

5．淋巴结：先用4%中性甲醛固定1小时后，再沿其长轴切成数片（厚 2 ~3mm），继续固定。

6．骨组织：先锯成小片（若是长骨应作横向锯片），在4%中性甲醛中固定24小时后，再进行脱钙。

7．微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹（需用大头针扎牢），然后放入专用小盒内进行中性4%甲醛固定，以防检材遗失。

8．凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号（病理号）。

㈤多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。

㈥组织块的切取和固定：①由较大标本切取用于制作切片的组织块（取材）时，应与标本的断面平行，组织块厚度一般为0.3 cm(不应>0.5cm)，面积一般在1~1.5×1~1.5以内。

②切取组织块的形状，在充分包括肉眼病变的前提下尽量规则些（例如方形、矩形、三角形等）；由一个标本切取的多块组织的形状有所不同，便于蜡块与其相应切片的核对。

③固定组织块的固定液量，一般应为组织块总体积的5~10倍以上。

④室内常温（25℃左右）下的固定时间为3~24小时；低温（4℃）下的固定时间应延长。

⑤固定组织块的容器要大一些。

⑥组织块固定期间需要间断地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。

㈦常用固定液1．4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液甲醛（40%） 100 ml无水磷酸氢二钠 6.5g磷酸二氢钠 4.0g蒸馏水 900ml2．乙醇－甲醛（酒精－福尔马林，AF）固定液甲醛（40%） 100ml95%乙醇 900ml［说明］一般组织块经乙醇－甲醛固定1～2小时后，即可移入95%乙醇内脱水。

3．Carnoy固定液无水乙醇 60ml氯仿 30ml冰醋酸 10ml［说明］组织化学染色的常用固定液，组织经Carnoy液固定1～2小时后，即可移入无水乙醇中脱水。

4．Zenker固定液升汞 5.0g重铬酸钾 2.5g硫酸钠 1.0g蒸馏水（加至） 100ml［说明］配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至40～50℃溶解后，再加入重铬酸钾，最后加入硫酸钠，贮存待用。

使用前加入5ml冰醋酸，混合。

组织块需固定12~24小时。

切片染色前，需进行脱汞沉淀处理。

5．Bouin固定液饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 75ml甲醛（40%） 25ml冰醋酸 5ml［说明］本液临用时配制。

组织块置于Bouin液固定12～24小时即可（小块组织只需固定数小时）。

经Bouin液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤12小时后进入乙醇脱水（兼脱色）。

不必将组织中的黄色除净（残存于组织中的苦味酸无碍染色）6．过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液（PLP）A液：赖氨酸 1.827g蒸馏水 50ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 50mlB液：8%多聚甲醛水溶液 100ml［说明］本液临用时配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终浓度为2%。

组织块在4℃下固定36~54小时。

本液对细胞结构和抗原性保存较好。

7．B5（醋酸钠－升汞－甲醛）固定液无水醋酸钠 1.25g升汞 6.0g蒸馏水 90ml［说明］将以上物质混合、溶解，使用前加入甲醛10ml。

本液多用于固定淋巴组织。

染色前应进行脱汞沉淀处理。

如不加甲醛称为B4固定液（蒸馏水为100 ml）。

8．丙酮固定液冷丙酮（4℃）固定液用于酶组织化学染色。

细胞标本的免疫组化染色也常用冷丙酮固定10分钟。

二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。

㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。

㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。

2．脱水（常温下）（1）乙醇－甲醛（AF）液固定 60~120min（2）80%乙醇 60~120min（3）95%乙醇Ⅰ 60~120min（4）95%乙醇Ⅱ 60~120min（5）无水乙醇Ⅰ 60~120min（6）无水乙醇Ⅱ 60~120min（7）无水乙醇Ⅲ 60min［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。

②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。

③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。

④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。

⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。

⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。

⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。

3．透明（1）二甲苯Ⅰ 20min（2）二甲苯Ⅱ 20min（3）二甲苯Ⅲ 20min［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。

②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。

③二甲苯应及时过滤、更换。

④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。

4．浸蜡（1）石蜡Ⅰ（45~50℃） 60min（2）石蜡Ⅱ（56~58℃） 60min（3）石蜡Ⅲ（56~58℃） 60min［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。

②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。

③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。

④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。

⑤熔蜡应及时过滤、更换。

5．包埋（1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。

（2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。

（3）待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。

（4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织块周围保留1~2mm石蜡为宜）。

将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。

（5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。

（6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。

（7）使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。

（8）注意事项①应将组织块严格分件包埋。

包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。

发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。

②必须严防各种异物污染，勿将无关组织（包括缝线、纸屑或其他异物（尤其是硬质异物）埋入蜡块内。

③包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。

④包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。

浸蜡Ⅰ用软蜡（熔点为45~50℃），浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡（熔点为56~58℃）。

⑤包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。

⑥熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。

包埋用熔蜡的温度应<65℃；包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。

6．切片（1）切片刀或一次性切片刀片必须锋利。

使用切片刀时，必须精心磨备（在低倍显微镜下确认刀刃无缺口）；使用一次性切片刀片时，应及时更新。

（2）载玻片必须洁净、光亮。

（3）将切片刀或刀片安装在持刀座上（以15°为宜）。

（4）将蜡块固定于持支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置（刀刃与蜡块表面呈5°夹角）。

（5）细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。

（6）修块（粗切）：用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。

修块粗切片的厚度为15～20μm。

［注意：对于医嘱再次深切片（特别是在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片），应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性。

］（7）调节切片厚度调节器（一般为4~6μm），进行切片，切出的蜡片应连续成带，完整无缺，厚度适宜（3～5μm）、均匀，无刀痕、颤痕、皱折、开裂、缺损、松解等。

（8）以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放入伸展器的温水中（45℃左右），使切片全面展开。

［注意：必须水温适宜、洁净（尤其是水面）；每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其它病例的组织碎片，以免污染。

］（9）将蜡片附贴于涂有蛋白甘油或经3－氨丙基－三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxy silane，APES)处理过的载玻片上（HE染色时酌情使用，可省略，必要时）。

蜡片应置放在载玻片右（或左）2/3处的中央，留出载玻片左（或右）1/3的位置用于贴附标签。

蜡片与载玻片之间无气泡。

（10）必须立即在置放了蜡片的载玻片一端（待贴标签的一端），用优质记号笔或刻号笔准确、清楚标记其相应的病理号（包括亚号）。