siRNA使用说明（2009-08）名称：常规化学合成siRNA。

产品简介：常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。

产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。

产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。

保存和使用：保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上；冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。

开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。

例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。

注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。

（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。

使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理；特别提示：荧光标记siRNA要求避光。

使用方法：1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。

（siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。

2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）：(1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。

注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。

而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。

(2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）：a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min；b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和；c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。

注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。

(3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和；(4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。

沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。

可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。

注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。

3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。

一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。

检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。

4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。

一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。

实验指导表1、使用lipofectamine2000（invitrogen）转染siRNA 用量参考（siRNA 转染浓度为10-100nM）V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000混和液总体积 加入转染试剂的量/孔孔板 siRNA 的终浓度20μM siRNA 的量/孔 siRNA 稀释体积 (Opti-MEM) （lipo2000） lipo2000稀释体积(Opti-MEM) 每孔中总体积(V1+V2) 100nM0.5μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)50nM0.25μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)30nM0.15μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)20nM0.1μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL))96-well 10nM0.05μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)100nM2.5μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)50nM1.25μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)30nM0.75μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)20nM0.5μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)24-well 10nM0.25μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)100nM5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 50nM2.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 30nM1.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 20nM1μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 12-well 10nM0.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 100nM10μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 50nM5μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 30nM3μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 20nM2μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 6-well 10nM 1μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL)表2、使用lipofectamine2000（invitrogen）siRNA 与DNA 共转染用量参考（siRNA 转染浓度为10-100nM） 孔板培养体积 质粒DNA 20μM siRNA siRNA/DNA 稀释体积(Opti-MEM)Lipo2000(μl) / 稀释体积 siRNA-DNA-lipo 2000总体积 96-well100μL 10-100 ng 0.05-0.5μL 25μL 0.2-0.5μL in 25μL 50μL 24-well500μL 100-200 ng 0.25-2.5μL 50μL 0.5-1.5μL in 50μL 100μL 12-well1 ml 200-500 ng 0.5-5μL 100μL 1.0-3.0μL in 100μL 200μL 6-well2 ml 500-1000 ng 1-10μL 250μL 2.5-6μL in 250μL 500μL 转染小贴示（以24孔板为例）：a. 24孔板每个孔的细胞培养总体积是500μL。

由于siRNA-lipo2000混和液的体积是100μL，转染前可以先将原细胞培养基（500μL）吸弃，更换为400μL 无抗生素（可含血清）的新鲜培养基，使得培养基体积与siRNA-lipo2000混和液体积之和刚好达到500μL。

转染时，各用50μL Opti MEM Ⅰ来分别稀释lipo2000和siRNA，对于24孔板，lipo2000用量是1μL/孔；siRNA 用量则根据所选用转染浓度而异（详见“实验指导”）。

b. 稀释lipo2000和siRNA 操作要点：lipo2000稀释后需要室温放置5min，才能与稀释好的siRNA 混合，因此，可以先稀释lipo2000，在静置期间再稀释siRNA。

两者稀释完毕，轻轻混合混匀，注意在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，过度用力可能会破坏脂质体的结构，以及siRNA-lipo2000混合物的形成。

上述混合液至少需要放置20min（室温），才能加到细胞培养板中，但是最长时间不能超过4-6h。

lipo2000用毕，请置于4℃冰箱，小心保存。

c. 混合液加板要点：siRNA-lipo2000混合液加入细胞培养板时，建议采用慢慢滴加的方法，从而防止局部脂质体浓度过高，对细胞造成损伤。

滴加完毕，轻轻摇动培养板，使混合均匀。

d. 在某些情况下（如转染效率不佳），可以尝试在血清饥饿的状态下转染，也就是转染前将原培养基换成400μL opti-MEM I 稀释液（无血清无抗生素的培养基），使得整个转染过程中，细胞都是处于无血清状态，注意这种情况下，转染完4～6h，必须进行换液操作。

e、在实验时，要求所有器具都应该是RNase-free的。

细胞培育基无法去除RNase，也无需对细胞培养基进行特殊处理，siRNA在转染时与培养基接触时间较短，另外siRNA-脂质体混合物的形成，对siRNA也有一定的保护作用。

f. 转染完成后在37℃的CO2培养箱培养24-72h，直到可以检测为止。

g. 对于筛选有效siRNA或需要首先确定有效转染浓度的实验，我们建议首先使用24孔板（3～5次实验）进行预实验，在正式实验开始后，请使用12孔板或6孔板（甚至更大的培养板），以确保后续实验过程中有足够RNA或蛋白量用于沉默效果的检测。

转染前后换液操作：1) 转染前换液：a. 如果细胞容易污染，在转染前一天铺板时，不能使用无抗生素的培养基，则经过18～24h培养后，在转染前务必要吸弃原培养基，更换成无抗生素的新鲜培养基（可以含有血清）。