控制菌检查
• 供试品检查
• 阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳
性对照试验。取阳性对照菌于相应选择性培养基
平皿上划线接种，按供试品的控制菌检查方法培
养，观察菌落生长情况。阳性对照试验应检出相
应的控制菌。
100μl
• 阴性对照试验 取增菌液0.1ml，照相应控制菌检
查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长
• 保管菌毒种应有严格的登记制度，建立详 细的总账及分类账。收到菌毒种后应立即 进行编号登记，详细记录菌毒种的学名、 株名、历史、来源、特性、用途、批号、 传代冻干日期和数量。在保管过程中，凡 传代、冻干及分发，记录均应清晰，可追 溯，并定期核对库存数量。
• 收到菌毒种后一般应及时进行检定。用培 养基保存的菌种应立即检定
志贺菌、沙门菌
项目
供试品检查中志贺 菌、沙门菌结果判 定及下一步鉴定指 导
2015版药典
2020版药典
供试品平皿培养24 若有疑似菌落生长， 小时、48小时各观 应进行分离、纯化 察结果1次，若未 及适宜的鉴定试验， 见菌落生长，判供 确证是否为志贺菌、 试品未检出志贺菌、沙门菌或制品中的 沙门菌；若有菌落 目的菌；若平皿上 生长，应与阳性对 未见菌落生长，或 照的菌落比较，并 虽有菌落生长但鉴 做革兰氏染色镜检 定结果为非控制菌， 等适宜的鉴定试验，判供试品未检出志 鉴别是否为制品中 贺菌、沙门菌 的目的菌或志贺菌、 沙门菌。
排除目的菌干扰的
• 因供试品为活菌制品，应选用能抑制目的 菌生长的选择性培养基进行检查。除另有 规定外，营养琼脂培养基用于非致病性杂 菌的计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌 计数。
也可采用其它经验 证的培养基
真菌计数
• 称取供试品1g，加到9ml 0.9%无菌氯化钠 溶液或其他适宜稀释液中，混匀，做10倍 系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml 加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基上，以 玻棒涂匀，一式3份，倒置，于恒温培养箱 中培养96小时，每天观察结果，记录平皿 上生长的真菌菌落数.
置适宜温度保存；种子批传代应限定传代 次数，原始种子批和主种子批启开后传代 次数不得超过10代，工作种子批启开后至 发酵培养传代次数不得超过5代。
生产用菌种
• 种子批的检定：应依据最新版伯杰氏细菌 系统鉴定手册和伯杰氏细菌命名手册的有 关规定进行，形态、生长代谢特性检查。 原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生 素敏感性等检查。
2020版药典
胰酪大豆胨液体培养 基或胰酪大豆胨琼脂 培养基
沙氏葡萄糖液体培养 基或沙氏葡萄糖琼脂 培养基
沙氏葡萄糖液体培养 基
100μl
每种培养基每一试验 菌株平行制备2个平 皿
非致病性杂菌、真菌计数
• 阳性对照
• 除另有规定外，真菌以白色念珠菌为对照 菌，其他以金黄色葡萄球菌为对照菌
• 变更为：当采用营养琼脂培养基或玫瑰红 纳琼脂培养基进行检查时，真菌计数以白 色念珠菌为对照菌，非致病杂菌计数以金 黄色葡萄球菌为对照菌
• 活菌数（CFU/g）=3个平皿菌落数之和/3*10*最终稀释度
附录3 微生态活菌制品杂菌检查法
• 微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品的菌粉 、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目 包括控制菌检查，非致病性杂菌、真菌计数。
变更：
项目 杂菌检查环境要求
细菌培养温度 真菌培养温度
铜绿假单胞菌
项目
供试品检查中 铜绿假单胞菌 结果判定及下 一步鉴定指导
2015版药典
2020版药典
如平皿上无菌落生长或生长的菌 供试品平皿上若 落与阳性对照菌落形态特征不符， 有疑似菌落生长， 判供试品未检出铜绿假单胞菌； 取菌落分离、纯 如平皿生长的菌落与上述菌落形 化后采用氧化酶 态特征相符或疑似，应挑选2-3个 试验及适宜的鉴 菌落，分别放在接种于营养琼脂 定试验，确证是 培养基斜面上，培养18-24小时。 否为制品中的目 取斜面培养物进行革兰氏染色、 的菌或铜绿假单 镜检及氧化酶试验，鉴别是否为 胞菌 制品中的目的菌或铜绿假单胞菌
增加：
若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定 结果为非控制菌，判供试品未检出铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌
项目
铜绿假单胞菌检测 中氧化酶试验
2015版药典 斜面培养物
应进行绿脓菌素试 验
2020版药典
分离纯化培养物
应继续进行适宜的 鉴定试验，确认是 否为铜绿假单胞菌
删除：绿脓菌素试验
金黄色葡萄球菌
2015版药典
2020版药典
供试品平皿上若未 供试品平皿上若有 见菌落生长或生长 疑似菌落生长，应 的菌落与阳性对照 进行分离、纯化及 的菌落形态特征不 适宜的鉴定试验， 符，判供试品未检 确证是否为大肠埃 出大肠埃希菌；若 希菌或制品中的目 生长的菌落与阳性 的菌；若平皿上未 对照的菌落形态特 见菌落生长，或虽 征相符或疑似，应 有菌落生长但鉴定 做革兰氏染色镜检 结果为非控制菌， 等适宜的鉴定试验，判供试品未检出大 鉴别是否为制品中 肠埃希菌 的目的菌或大肠埃 希菌。
销毁四类菌毒 种须经单位领 导批准。销毁 后应在账上注 销，作出专项 记录，写明销 毁原因、方式 和日期。
生产用菌毒种应按各论要求进行检定
二、微生态活菌制品总论
• 微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成，无 论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳 定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制 成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径 和方法可制备成片剂、胶囊颗粒剂或散剂等多种 剂型。
基本要求： 微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证
成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时 应防止外源因子的污染。生产和检定用设施、原 材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例” 的有关要求。
生产用菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌 毒种管理规程”的有关规定
• 名称及来源； • 种子批的建立：三级种子批应分别冻干，
2015版药典
10000级下的局部 洁净度100级 30-37℃
20-28℃
2020版药典
不低于D级背景下 的B级 30-35℃
20-25℃
附录3 微生态活菌制品杂菌检查法
新增：
由于供试品本身含有大量活菌，可能在杂菌检 查所用的培养基上生长，干扰杂菌回收或结果 判断，在建立或修订方法时应考虑其适用性， 充分了解供试品活菌在杂菌检查培养基上的生 长特性。除本附录收载的杂菌检查用培养基之 外，亦可采用其他经验证的培养基。
微生物检测用菌来源： CMCC:中国医学细菌保藏管理中心 CICC:中国工业微生物菌种保藏管理中心 ATCC:美国微生物菌株保藏中心
• 生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统 。每批主种子批和工作种子批均应按各论 要求保管、检定和使用。
• 菌毒种的传代及检定实验室应符合国家生 物安全的相关规定。
• 各生产单位质量管理部门对本单位的菌毒 种施行统一管理。
删除：血浆凝固酶试验
• 控制菌检查用培养基的适用性检查
变更:
项目 细菌增菌培养基
真菌增菌培养基
白色念珠菌涉及 检验培养基 试验菌用量 固体培养基促生 长能力检查
2015版药典
营养肉汤培养基或 营养琼脂培养基
改良马丁培养基或 改良马丁琼脂培养 基 沙氏葡萄糖肉汤培 养基
0.1ml
每种培养基平行制 备2个平皿
。
• 大肠埃希氏菌； • 志贺菌、沙门菌； • 铜绿假单胞菌； • 金黄色葡萄球菌； • 梭菌； • 白色念珠菌；
变更：
项目 增菌培养
特异培养
2015版药典 2020版药典
称取供试品1g，称取供试品1g，
加到9ml灭菌 加到至少9ml
增菌液中
灭菌增菌液中
0.1ml
100ul
大肠埃希氏菌
项目
供试品检查中大肠 埃希氏菌结果判定 及下一步鉴定指导
2. 理化检查 3. 活菌数测定
按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规 定。多价制品应分别测定各单价活菌数。
4. 杂菌检查
方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。
5. 安全试验（新版已删除）附录2 微生态活菌制品活菌数测定法
• 无菌称取3.0g制品或菌粉（胶囊取内容物），加入27.0ml 稀释液中，充分摇匀，做10倍系列稀释（最终稀释度根据 不同的指标要求而定）。取最终稀释度的菌液100μl，滴 入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂 布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长 情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调 整最终稀释度，重新测定。
新版药典变更解读
——微生物相关
分析质检中心微生物组 2020年05月
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涉及内容
药典三部： • 生物制品通则：《生物制品生产检定用菌
毒种管理规程》 • 总论：《微生态活菌制品总论》（变更）
通则
• 1101 《无菌检查法》（变更） • 1105 《非无菌产品微生物限度检查：微生物计
数法》 • 1106 《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检
附录3 微生态活菌制品杂菌检查法
新增：
如果供试品本身对某些试验菌具有较强的抑菌 性能，影响试验菌的回收。在此情况下，应根 据原辅料的杂菌负载、生产工艺及产品特性进 行风险评估，保证检验方法的可靠性；在药品 生产、贮藏各个环节中，应严格遵循GMP的指 导原则，以降低产品受杂菌污染的风险。
附录3 微生态活菌制品杂菌检查法
新增：
控制菌检查法检出意思致病菌时，可参考“微生 物鉴定指导原则（通则9204）”的提示进行后续 确证，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定 方法。
检验量及供试品的准备
• 检验量，即一次试验所用的供试品量（g）。 检验时，应从2个以上最小包装单位中随机抽 取不少于3倍检验用量的供试品。