植物内生菌的分离钱昆121140041一、实验目的1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。
3、了解微生物分子实验的基本操作流程。
二、实验原理在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。
对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。
但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。
因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。
植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。
内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。
植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。
内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。
对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。
根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
但需要注意的是，同种细菌定殖于不同宿主植物可能对宿主植物产生不同的影响。
除根瘤菌外，还有放线菌侵入多种被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮体系。
早在十九世纪后期，人们就发现了这类非豆科的根瘤，并发现根瘤内有生微生物，1881年布隆科斯特将它称为Frankia，但当时并不知道它是什么微生物。
确定内生菌是放线菌，将它分离出来，在人工培养上获得纯培养，并回接成功，则是1978年卡拉汉姆在杨梅科香蕨木上首次证实的。
内生菌在植物体中的生物量是很微少的，但植物内生菌作为植物微生态系统中的天然组成部分，可以通过自身的代谢产物或借助信号传导作用对宿主产生影响。
现已发现内生菌对宿主植物至少有以下几个方面的有益作用：固氮作用、促进宿主植物生长、抗逆境、抗病原真菌和细菌以及他感作用等。
三、实验器材实验器材：植物叶片（如冬青叶等）、烧杯（6个）、镊子、剪刀、接种环、酒精灯、灭菌锅、光学显微镜、载玻片、培养皿、锥形瓶、PCR扩增仪、电泳槽、凝胶槽、梳子、移液枪、微离心管等；实验试剂：75%酒精、1%次氯酸钠溶液、无菌水、结晶紫染液、蕃红染液、碘液、95%酒精、缓冲液、琼脂糖等。
四、方法与步骤1、培养基的配置需要准备3种培养基即牛肉膏蛋白胨培养基用于培养细菌、PDA培养基用于培养真菌、高氏培养基用于培养放线菌，每种培养基设置2次重复，即共配置6个培养基。
培养基配方及简单的操作流程：牛肉膏蛋白胨培养基：配方：牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、NaCl 1g、琼脂 4g、水200ml、pH7.4-7.6操作流程：依次称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，热水溶解→加入琼脂，热水融化，融化后加水至所需体积→调pHPDA培养基：配方：马铃薯40g、蔗糖3g、琼脂4g、水200ml（自然pH）操作流程：加入马铃薯粉末，溶解→加入琼脂，热水融化→加入葡萄糖，搅拌均匀→稍冷却后，加水至所需体积高氏培养基：配方：可溶性淀粉4g、NaCl 0.1g、KNO3 0.2g、K2HPO40.1g、MgSO40.1g、FeSO42mg、重铬酸钾10mg、琼脂4g、水200ml操作流程：热水溶解淀粉→依次加入各无机试剂→混匀后加入琼脂，热水溶解→补充水分至所需体积→调pH至7.4-7.6由于实际操作时有配置好的培养基固体粉末，所以将各种培养基粉末计算好质量后，称取并用定量自来水溶于锥形瓶中，混匀，编号，放入灭菌锅中灭菌消毒，消毒完毕使培养液稍加冷却后，倒平板，静置使培养基凝固。
2、植物叶片内生菌的分离(1)采集新鲜植物叶片，要求叶片上无菌斑，带回实验室后洗净、稍晾干；(2)将叶片剪成大块（去掉叶柄，可将叶片沿主叶脉剪开成两大块），稍加修剪，使叶片能水平放入小烧杯中；(3)准备六个干净烧杯，取三个倒入冷却后的无菌水，另外取两个倒入75%酒精，最后一个倒入1%次氯酸钠溶液。
将处理后的叶片依次用75%酒精浸泡1min、1%次氯酸钠浸泡10-15min、75%酒精浸泡1min（不断搅动），然后在三个盛有无菌水的烧杯中依次浸洗，取出叶片，用无菌滤纸吸干水分；(4)叶片稍晾干后，将其剪为1cm2大小的小片，周围均要有切口，在酒精灯旁用消毒后的镊子将小叶片放入培养皿中，每个培养皿放5片，放好后标记；(5)将培养皿置于28℃培养箱中培养一周，一周后取出观察是否有菌落从植物材料切口内长出至培养基上，并对细菌转移至培养斜面，编号记录，继续进行分离。
3、内生菌形态结构观察(1)细菌观察革兰氏染色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：a)涂片固定。
b)草酸铵结晶紫染1分钟。
c)自来水冲洗。
d)加碘液覆盖涂面染约1分钟。
e)水洗，用吸水纸吸去水分。
f)加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
g)蕃红染色液（稀）染3到5分钟后，自来水冲洗。
干燥，镜检。
(2)真菌、放线菌观察用解剖针或接种环挑取少量菌落涂于载玻片上，或用胶带在菌落上粘取少量菌丝于载玻片上，再放在显微镜下观察。
4、PCR扩增将下列物质加入微离心管中：Taq 0.5μl、10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、TE 10μl、引物1 1μl、引物2 1μl、水6.5μl操作时先加入TE溶液，然后用消毒的接种针挑取少量待扩增菌溶于其中，再加入其它物质。
加完后混匀，放入PCR扩增仪中。
5、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备：用1×TAE缓冲液配制质量浓度为0.1 g/L的琼脂糖凝胶，加EB至终浓度为0.5 μg/mL。
凝胶板的制备：放置梳子，趁热倒胶，使其自然凝固。
样品的制备：选取样品并加入1/5体积溴酚蓝溶液。
加样：加样端为负极（黑）电泳：10 V/cm电泳40 min。
观察：紫外灯下观察，照相。
五、实验结果最终从叶片中分离出5种细菌、2种真菌，没有分离到放线菌。
细菌革兰氏染色观察结果：1、芽孢菌体呈短棒状或杆状，革兰氏染色呈阳性，可以观察到芽孢结构，形成的菌落呈暗黄色。
从第一次分离的较大叶片中得到。
2、菌体呈杆状，为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色。
从视野中看到有少量阳性菌及芽孢存在，可能是由于培养或挑取菌时污染所致。
从第二次分离的冬青叶片中得到。
3、菌体呈球状，比观察到的其他球菌小，革兰氏阴性菌，菌落呈橙色。
从第一次分离的较大叶片中得到。
4、菌体呈球形，革兰氏阴性菌，菌落呈黄色。
从第二次分离的冬青叶片中得到。
5、菌体呈球形，革兰氏阳性菌，菌落白色偏黄。
从第一次分离的较大叶片中得到。
真菌观察1、第一次分离得到的真菌菌丝（40倍物镜观察）：2、第二次从冬青叶中分离到的优势真菌菌落：挑取菌丝观察（40倍物镜观察）：局部放大：孢子胶带粘附孢子观察（40倍物镜观察）：琼脂糖凝胶电泳六、问题讨论及注意事项1、采摘叶片时要尽量选择没有菌斑的健康叶片，尽量不要选择新生叶片，虽然几乎没有菌斑但内生菌数量较少，不易分离。
2、倒平板前培养液应先冷却至50度左右，如果倒平板时温度过高会产生较多水汽，尤其在放线菌培养过程中要控制培养皿内的湿度，湿度过高不利于放线菌的生长。
倒平板时温度过高产生水汽较多，使得湿度较大可能是放线菌没有长出的原因之一。
3、用酒精和次氯酸钠进行消毒时间不宜过长，如果时间过长容易造成叶片失活，内生菌同样被灭活。
第一次进行分离时可能由于消毒时间过长，在培养时部分叶片已经完全发黑。
4、将叶片剪成小块后要保证四面均有缺口，并且已剪掉消毒后产生的黑边，而且不能再用水清洗，以免内生菌流失。
5、操作过程尽量做到无菌操作，避免空气中的杂菌进入培养皿。
第一次分离过程中污染较严重，大部分培养基都有霉菌长出，结果使得污染较严重的培养基无法继续培养。
6、细菌染色过程中，如果需要挑取得菌落周围有其他菌落，要小心操作避免沾染其他细菌，否则会使染色结果中无法分辨出哪些是目标菌。
7、PCR操作过程中，微离心管中加入TE溶液再加样品时，所挑菌量不宜过多，避免在扩增后的溶液中产生沉淀。
8、分离真菌时由于优势菌落形成而抑制了其他真菌的生长，使得分离到的多是优势种；放线菌没有分离到，原因可能是：(1)倒平板时温度较高，培养基的环境较为潮湿，不利于放线菌的生长；(2)叶片灭菌过度，叶片有的部分或完全变黑；(3)放线菌分离所需时间较长，而由于培养基污染严重，霉菌等杂菌已经覆盖了培养基表面，无法继续使用，所以放线菌培养基仅培养了一周，放线菌可能还没有开始快速生长；(4)第二次用冬青叶片进行分离时，培养基内重铬酸钾的量过多，使得放线菌无法生长。