例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿
距离为16.0 cm 时，两斑点质量重心至原点的距离分别为 6.9 cm 和5.6 cm，斑点直径分别为0.83 cm 和0.57 cm。 求两组分的分离度及Rf 值。 解：
2d 2 (6.9 5.6) R 1.9 W1 W2 0.83 0.57
一般低温展开效果较好 温度 物质极性
•
展开剂极性 展开剂极性↑ Rf 极性物质Rf ↑ 亲脂性组分Rf ↓ 展开剂蒸气
极性大，Rf小 极性小，Rf大
•
对Rf 影响较大，应先让溶剂蒸气将层析缸饱和
例:用纸色谱分离，正丁醇为流动相，比较下面三个化合物的 Rf
CHO HC HO CH HC HC OH OH OH
1 Rf 1 k
k (1 Rf ) / Rf
Vm: 薄层板的死体积; K: 该条件的分配系数
VS: 板固定相体积;
在色谱条件确定的情况下，K大Rf 小，K小Rf 大。
分离物质性质 薄层板性质 Rf 影响因素 展开剂极性 温度 展开剂蒸气饱和程度
(2) 相对比移值 (retardation factor, Rr ) 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。 可用相对比移值定性。
5.6 0.35 16.0
Rf,A
6.9 0.43 16.0
Rf,B
四. 薄层色谱法
点样
展开
过程：铺板→活化→点样→饱和→展开→显色→定性定量
1. 原理:
将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密
闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断 地被吸附, 解吸附… 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分 的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。
平面色谱法主要有薄层色谱法（TLC）和纸色谱法。
优点：仪器设备简单，费用低；对样品预处理要求不高；
可同时分析多个样品。
缺点：固定相颗粒较大且不均匀；常压下输送流动相；
离线检测、分析周期长。
应用：产品纯度控制、杂质检查、天然药物有效成分分离、
中药定性鉴别等。
二. 液–固 吸附柱色谱
吸附色谱：
CHO HO HO CH CH HC HC CH3 OH OH
CHO CH2 HC HC HC CH3 OH OH OH
CH2OH
a -OH数 亲脂性基团 分子极性 Rf 葡萄糖(a) 5 0
b
c
鼠李糖(b) 洋地黄毒糖(c) 4 3 -CH3 -CH2, -CH3 a>b>c a<b<c
例. 在硅胶粘合薄层板上，用氯仿作展开剂，对某极性物质
5. 定性和定量分析 5.1 定位
-日光下显色
本身有色 -显色剂
• 碘 • 硫酸 • 茚三酮等
定 位
-荧光薄层板 +荧光物质 紫外灯下 -紫外吸收物 质
显色
- 荧光薄层板 常用硅胶GF254板
5.2 定性分析：比较组分与对照品 Rf值
对未知样品，要几个展开体系均有一致Rf 值，
或双向展开法确认。
Rr
Rf(a) Rf(s)
la ls
参考斑可以是另加的物质，亦可以样品中另一组分为参考。 特点： 消除系统误差
Rr 可以小于1，也可大于1
2. 分离参数 分离度(resolution; R )
2d R W1 W2
d 两色斑中心间的距离。 W1、W2两色斑的峰宽(扫描测定)。一般亦可用纵向直径。
2～3 mm。
点样量太大,
斑易拖尾, 影响分离效果。
注: 有时用于薄层制备与分离提取时,条状点样。
点样位置:
距底边1.5～2cm处, 铅笔画线、点点。
4.2 展开 先饱和15～20min，防止边缘效应 展开剂浸薄层板下端0.5cm，不能浸住起始线 层析缸应密闭 展开方式：单向展开，双向展开……
符号:

吸附剂(硅胶), 粘合剂(煅石膏), 掺入荧光剂254 nm, 呈黄绿色。
薄层板的铺制
常用平滑的玻璃板，洗净待用。

软板: 吸附剂直接铺涂。最大缺点，风吹即飞(已不用)。 硬板: 吸附剂+粘合剂糊状铺板凉干活化
常用粘合剂: CMC-Na 羧甲基纤维素钠。( 0.25～0.75%的
吸附原理：利用分子内酰胺基和羰基,可与酚、酸、硝基化 合物等形成氢键。 吸附力与能形成氢键的基团有关，对位间位取代基均能形 成氢键的,吸附力增大。 邻位基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。 芳香核具有较多共轭键时,吸附力增大。
3.4. 吸附剂的活度 氧化铝，硅胶的吸附力大小与其含水量有较大关系。
5.3 定量分析
薄层扫描 洗脱法 目视比色 • 比较色斑大 • 刮下 • 溶解 • 光度法测定 • 误差±5%
• 误差<5%
小、深浅。
• 误差±10％
五. 纸色谱法 1. 基本原理 液—液分配色谱 载体 固定相 滤纸的纸纤维 滤纸上吸附的水
流动相
与水不相混溶的有机溶剂
操作类似于薄层色谱法，但原理不同
进行分离，Rf值几乎为 0，若欲得合适的 Rf值，则要改变展
开剂的极性，可选用下列哪种展开剂进行试验?( A氯仿和环己烷 B氯仿和甲醇混和溶剂 C环己烷 )
答案：B
例. 硅胶板、石油醚-苯（4：1），Rf 次序？
N N
P 324
OCH3
N
N
偶氮苯
HO N N
对甲氧基偶氮苯
HO N N N N
苏丹黄
定性参数 Rf
2. 实验条件选择:
(1) 选纸: 质地均匀, 无折痕。
若Rf小, 选中速或快速滤纸; 若粘度大,选质地松的滤纸。若 组分多,选中速或慢速滤纸。一般常选中速滤纸。 (2) 点样: 一般几～几十 g, 2～3 mm (3) 展开: 先饱和, 再展开。 (4)定性: Rf 显色：与薄层一样 (5)定量: 剪下,洗脱,光度法定量。
CMC-Na水溶液与吸附剂3:1调粘研磨…)

活化: 凉干的板在110℃活化1小时，于干燥器中备用。
3. 展开剂选择: (同柱)仅操作方法不同。
分离强极性物质, 选择强极性展开剂, 同时也应考虑固
定相的活性。
分离混合样品时, 展开剂选择一般规则: (1)先用单一的中等极性展开剂试一下。 (2)改用二元展开剂, 其比例要摸索。 目的: 改变展开剂的极性。
∴ Ka = [Xa] / [Xm]
流动相大量的, 视为常数。
—— 吸附常数
组分Ka越大, tR越长。(组分易被吸附,移行速度慢,保留值就大)。
2.吸附等温线
一定温度下 , 某组分在吸附剂表面达到吸附平衡时 , 该组 分在两相中的浓度相关曲线。
等温线 直线型(a) 凸型 (b) 凹型 (c)
色谱峰 对称 拖尾 前沿
4.1. 被测组分性质（极性大小）： 判断物质极性大小的规律：

基本母核相同，分子中基团的极性越强，分子的极性越强； 基本母核相同，分子中极性基团数目越多，分子极性越大；


分子双键多，吸附力↑，共轭度↑，吸附性↑。
空间排列, 影响极性。
OH C O O H O
<
HO
C OH
形成氢键，极性小
常见化合物极性： 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类
经典液相色谱法
1. 概述 2.液-固吸附柱色谱法
3.平面色谱参数
4.薄层色谱法
5. 纸色谱法
一、概 述
以液体为流动相的色谱称为液相色谱法。
根据操作形式的不同液相色谱法可以分为柱色谱法 (column chromatography) 和平面色谱法(planar chromatography)。 色谱过程在固定相构成的平面内进行的色谱法称为平面色 谱法。
以一些多孔性物质，表面布满吸附位点(吸附中心)的固体吸
附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等；流动相可以是各种不同 极性的一元或多元溶剂。 吸附: 溶质在液—固、气—固 两相交界面上集中浓缩的现象。
它发生在固体表面上。
液–固 吸附柱色谱：将固体吸附剂装入管状柱内，用液体 流动相进行洗脱的色谱法。
吸附过程是样品中溶质分子和溶剂分子争夺吸附剂表面活性
活性级越大，含水量越多，吸附能力越小，活性越小 活性 ≠ 活性级 活化：105～110℃加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。
4. 流动相的选择：
流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。
要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗脱)。 选择流动相应考虑三方面： 被测组分、吸附剂和流动相的性质——极性 流动相的洗脱实质：流动相分子与被分离分子竞占吸附剂 表面活性中心的过程。
RfA= l1/ l0
一般: 0 ≤ Rf ≤ 1
RfB = l2 / l0
Rf 可用范围：0.2-0.8
Rf 最佳范围：0.3-0.5 Rf是平面色谱的定性参数, 在同一色谱条件下, 同样结构的分
子有相同的Rf值。
Rf与分配系数和保留因子的关系
Vm 1 Rf 1 KVs / Vm Vm KVs
TLC 特点： 快速；灵敏(几～几十微克)；高选择；显色方便。
2. 固定相 (stationary phase)

吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用, 但薄层色谱所用 的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。

硅胶 40 m (一般要求200目左右) 硅胶G 硅胶H 硅胶HF254 硅胶GF254 硅胶 + 煅石膏 硅胶(未加任何物质) 硅胶不含粘合剂+荧光物质 硅胶+煅石膏+荧光物质