地理条件 （南方北方土壤）
工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是 霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。 原因：南方温度高，温暖季节长，雨水多，相 对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤 有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。
季节条件
冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少 春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加 春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良 7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中 微生物数量比任何时候都多 秋季取样最好
采土样最好 的土层是 5～25cm 微生物类群较多，生长旺盛， 细菌、放线菌较多；霉菌、酵 母菌生产多
土壤酸碱度和植被状况
偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线 菌生长 偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长 旺盛 番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌 葡萄或其他果树根部附近土壤中酵母菌数量增多 豆科植物根瘤菌
分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂， 它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利 于厌氧菌的生长繁殖。 筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑 制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所 需的菌株
三、好气微生物的分离
经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖， 占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但 并未死亡。因此，经过富集培养后的样品，也需要进 一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分 离出来。 分离方法：一类较为粗放，“菌落纯”；一类较细 的单孢子或单细胞分离方法，“菌株纯”，“细胞 纯”。
高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物； 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；
1、控制培养基的营养成分
环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该 物质的微生物也较多。在分离该类菌株之前，可在增 殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖， 其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。 分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底 物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最 佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培 养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微 生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此 时分离将得到所需的微生物。
收集和筛选 的途径：
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需 菌株 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等， 从中进行分离筛选 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的 产生菌等
本章内容
一、 含微生物样品的采集 二、 富集培养 三、 好氧微生物的分离 四、厌氧微生物的分离
如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 需注意， 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； pH可分离嗜酸或嗜碱微生物 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 养基的性质，从而改变选择压力。 养基的性质，从而改变选择压力。 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉 菌素等 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到 固体培养基上。 固体培养基上。 移植时间是关键， 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势 的情况下进行。 的情况下进行。
一、 含微生物样品的采集
1、从土壤中采样 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分 离到任何所需的菌株。 细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）> 酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）
1）根据土壤特点采样
比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握
土壤有机质含量和通气状况
有机质含量丰富：耕作土、菜园土和近 郊土壤 ；森林土壤，枯枝落叶多的土壤
2）采样方法
塑料袋编号并记录地点、土 壤质地、植被名称、时间及其 他环境条件 样品取回后应马上分离， 以免微生物死亡 路途遥远或者取样太多，选择性 培养基做好试管斜面
2、根据微生物生理特点采样
筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等 采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘 蔗渣堆积处采样 森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 肉类加工厂附近、饭店 排污沟，易分离到蛋白 酶和脂肪酶产生菌。面 粉加工厂等场所易分离 到产淀粉酶、糖化酶的菌
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不 利于其他菌型生长的条件，例如， 利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的 基质或加入某些抑制剂。 基质或加入某些抑制剂。 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性
高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；
分离解脂微生物(吐温为底物 尼罗红作指示剂) 吐温为底物， 又如 分离解脂微生物 吐温为底物，尼罗红作指示剂 豆油作底物 中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示 菌落周围呈红色圈 甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 罗丹明 为指示剂 荧光圈
带正电、加美兰、 聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈） 呈现透明圈）
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。 间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的
2）、变色圈法 ）、变色圈法
富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相 应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状 真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸 膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。 特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长， 而不利于孢子的产生。 根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的 特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓 度污染物的环保菌。比如：降解高浓度苯胺的微 生物分离；环己烷降解菌的分离
3、抑制不需要的菌类
通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微 生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到 富集的目的。 芽孢杆菌的筛选：芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀 死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃ 或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后 再进行分离。 革兰氏阴性菌：富集培养基中加入适量的胆盐和十 二烷基磺酸钠
筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源 的菌株
杨 尺 蠖
鳞翅目尺蛾科
赤 松 毛 虫
侧 柏 毛 虫
二、含微生物样品的富集培养
富集(enrichment)培养 富集(enrichment)培养 (enrichment) 是在目的微生物含量较少时，根据微生物 的生理特点，设计一种选择性培养基，创造 有利的生长条件，使目的微生物在最适的环 境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自 然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
1、稀释涂布法和划线分离法 、
1）稀释涂布法 稀释涂布法
2）.平板划线分离法 平板划线分离法 采用无菌操作法， 采用无菌操作法， 以接种环沾取少许 待分离的样品， 待分离的样品，在 无菌平板表面进行 平行划线、扇形划 平行划线、 线或其他形式的连 续划线 ，如果划线 适宜的话， 适宜的话，微生物 能一一分散， 能一一分散，经培 养后，可在平板表 养后， 面得到单菌落。 面得到单菌落。
2、控制培养条件：pH、温度及通气
富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求 范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要 的菌类。 分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20 分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌 数目，达到富集的目的。 筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性， 设计适宜的培养条件，达到富集的目的。 厌氧菌需要特殊的装置
第二章 工业微生物产生菌的分离筛选
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种 微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要 求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他 们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。 工业微生物产生菌的筛选：
一是从自然界分离所需要的菌株，二 是把分离到的野生型菌株进一步纯化并 进行代谢产物鉴别。
增殖培养
纯种分离
生产性能测定
筛
调查研究（包括资料查阅） 调查研究（包括资料查阅）
选
试验方案设计
工
采样
作
增殖条件探索 第一次增殖培养
程
第一次平板分离 第 次增殖培养 第一次
序
第 次平板分离
第 次
（11ຫໍສະໝຸດ ）第三次平板分离第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第三次菌种保藏
第四次原种斜面 初步工艺条件摸索 再复筛 1株3-5瓶 株 瓶 较优菌株 保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株 某些必要试验和毒性试验 种子培养
比如分离淀粉酶产生菌：淀粉作为碳源 比如分离淀粉酶产生菌：
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性 蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上 的不溶性蛋白质，产生一透明圈。
分离某种产生有机酸的菌株时， 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状， 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解， 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标： 在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 、 2、菌的生长温度 、 3、菌的稳定性 、