芽孢杆菌的分离与鉴定实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。
实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂；一、土壤中芽孢杆菌的筛选A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中；（2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量；（3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6；（4）过滤：用滤纸过滤；（5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分；（6）分装与包扎：摆斜面（7）灭菌：121℃，灭菌20minB.实验步骤：（一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。
取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。
将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。
（二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。
（三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。
（四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。
平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。
（五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。
（六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。
（七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。
(八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。
二、纯化菌株的鉴定：（一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：A.细菌的革兰氏染色1、涂菌：用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
2、干燥：于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3、固定：目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。
此制片可用于染色。
4、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。
5、媒染：滴加卢戈氏碘液，冲去残水，滴两滴卢戈式碘液，覆盖住菌膜。
1min后水洗。
6、脱色：滴加95%乙醇脱色，30s后立即水洗或用卢戈式碘液流加冲洗至流出液刚好无色，立即水洗。
7、复染：滴加番红或复红液复染lmin，水洗。
8、滤纸吸干、油镜镜检：革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。
B.细菌的芽孢染色(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。
(2)加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。
(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
(7)干燥后用油镜观察。
芽孢绿色，菌体红色。
三、生理生化试验1、芽孢杆菌对生物大分子的分解利用（1）明胶(Gelatin)液化试验A.试验原理：明胶是一种具有在温水中溶解时形成凝胶性质的动物蛋白质，某些细菌能分泌蛋白酶分解其中蛋白，致使失去凝胶性质而没有凝固性。
明胶的分解是一种酶促反应，与这一变化有关的酶称明胶酶，无此酶的微生物则不能液化明胶。
在20℃以下的室温观测生长情况和明胶是否液化。
如菌种已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。
如明胶凝块部分或全部在37℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。
如菌种已生长，明胶未液化，但明胶表面菌苔下出现凹陷小窝(须与未接种的对照管比较，因培养过久的明胶因水分散失也会凹陷)也是轻度水解，按阳性记录。
若菌种未生长，则或是不在明胶培养基上生长，或是基础培养基不适宜。
B.明胶(Gelatin)液化培养基：蛋白胨1g，明胶20一30g，水200ml，pH7.2-7.4，分装试管，培养基高度约4．5cm，115℃灭菌。
C.实验步骤: 1、取四支明胶（高层）培养基试管，用记号笔标记号。
2、挑取18-24h的菌种穿刺接种子明胶(Gelatin)液化培养基，并有两支未接种的空白对照。
于37℃温箱中培养，培养2-5天。
3、观察明胶的液化情况。
（2）淀粉水解试验A.原理：某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶，使淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖等小分子物质，在被细菌吸收利用，淀粉水解后，遇碘液不再变蓝色。
观察细菌的生长情况，如果菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉水解，为阳性。
透明圈的大小可以初步判断细菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
B.淀粉水解试验培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，可溶性淀粉0.2g，琼脂1.8g，ph7.2,121℃灭菌30min。
配置时，先用少量水将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅边加水及其他成分，溶化后补足水分。
C.试验步骤：1、将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌制成平板。
2、用接种针取少量待检菌在平板上划“十”形接种。
3、将平板倒置在37℃温箱中培养24小时左右。
4、观察细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量lugol’S碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察菌苔周围是否出现无色透明圈。
2、芽孢杆菌对含氮化合物的分解利用（1）吲哚试验A.实验原理：吲哚实验是用来检测吲哚的产生。
有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚与对二甲基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生物都有分解色氨酸的能力，因此吲哚实验可以作为一个生物化学检测的一个指标。
B.吲哚培养基：蛋白胨1g，nacl0.5g，蒸馏水100ml，ph7.2-7.4，高压蒸汽灭菌115度20min。
C.吲哚试验试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇(95％)760m1，浓HCl l60ml。
D.吲哚试验步骤：1、将细菌分别接种于装有蛋白胨培养液的试管中，置37℃恒温箱中培养24—48h。
2、在培养液中加入乙醚l-2mL，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管。
以防破坏乙醚层影响结果)3、观察结果：如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，即为吲哚试验阳性反应，否则为阴性。
3、芽孢杆菌对碳水化合物的分解利用（1）V-P试验A. V—P试验原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成红色化合物，即伏-普反应阳性，不产无色物质者为反应阴性，称V—P反应。
B. V—P试验培养基：蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，k2HPO4 0.5g，水100ml，pH值7.0-7.2，每管分装4.5ml，115℃灭菌C. V-P试验（乙酰甲基甲醇试验）步骤：1、用无菌接种环挑取单个菌落分别接种于有5mL萄萄糖蛋白胨培养液的试管中，置37℃恒温箱中培养24—48h。
2、取出试管，振荡2 min，再加入40%NaOH溶液lO一20滴，并用牙签挑入约O.5-lmg肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15-30min后。
3、观察结果。
若培养液呈红色，即为V-P试验阳性反应，否则为阴性。
4、芽孢杆菌的运动性观察（穿刺培养）：（1）取两支牛肉膏蛋白胨半固体培养基，用接种针粘取少许菌苔，沿试管中央自上而下穿入，尽量沿原路返回，穿刺线要直。
（2）置于37℃温箱中培养48小时左右。
（3）观察菌体在半固体培养基中的生长状况，若向四周扩撒，说明能运动，着生鞭毛。
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
为好氧或兼性厌氧的杆菌，一般为革兰氏染色阳性。
在某种环境下，菌体内的结构发生变化，经过前孢子阶段，形成一个完整的芽孢。
芽孢对热、放射线和化学物质等有很强的抵抗力。
在化学组成方面，在芽孢内含有大量营养细胞中不存在的二吡啶羧酸的钙盐；在结构方面，芽孢的原生质外围有三层膜，从内到外是厚的皮层（cortex）、孢子壳和孢子外膜。
在芽孢杆菌属中，对种的划分是以菌体的大小、孢子的形状及其在菌体内的位置、糖的利用及其产物、能否还原硝酸，以及在高浓度的食盐条件下能否生长等为依据。