本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
材料与方法一、材料与培养用液的配制CK 型倒置显微镜(日本Olympus Tokyo 公司),流式细胞仪(Coulter 公司),BB 5060型CO 2培养箱(美国Heraeus),Cryfuge500S 型低温离心机,胎牛血清(FBS,100ml/瓶,H yclone 公司),人血管内皮生长因子(VEGF,10 g/支,Pepro Tech 公司),CD31PE 购自Becton Dickison 公司(编号:340297)。
培养用液:(1)PBS 液:Nacl 8.5g 、Kcl 0.2g 、NaH 2PO 4H 2O 2g 、KH 2PO 40.2g 溶于1000三蒸水中,120!灭菌20m in,分装备用。
(2)胶原酶(Gibco公司,10mg/支)和胰蛋白酶(上海华美公司)分别溶于100ml PBS 中,浓度分别为0.1%和0.25%,抽滤消毒备用。
(3)DMEM 培养基(购自BRL-Gibco 生命技术公司):按照说明书操作,将一袋干粉溶于1000ml 三蒸水中,抽滤消毒,加入胎牛血清终浓度为10%,4!贮存备用。
二、方法1.内皮细胞原代培养:无菌获取新生儿脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,再用PBS 液冲净脐静脉内血迹。
将脐带一端用丝线结扎固定,用注射器向脐静脉另一端内注满0.1%胶原酶液,止血钳钳夹后放入水浴锅内孵育15min 。
取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中,再用PBS 液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中,1000rpm ∀8min 。
弃去上清液,转移至35cm 2培养瓶(Falcon 公司)中,加入DM EM 培养液(内含10%胎牛血清,青霉素100U/ml、链霉素100 g/ml,VEGF20ng/ml), 5%CO2、37!条件下培养,24h后换液1次,以后每2 ~3d换液1次。
2.传代培养:原代培养内皮细胞80%以上汇合时,倾去培养液后用DM EM培养液冲洗,然后加入0. 25%胰蛋白酶消化,在倒置显微镜下观察见细胞皱缩、彼此分离或出现大片状分离即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化,并用吸管反复吹打瓶壁制成细胞悬液,计数后按105个/ml分装成瓶继续培养。
3.血管内皮细胞的鉴定(1)倒置显微镜下观察细胞形态并摄片,待培养细胞将近汇合时,更换新鲜培养液摄片。
(2)流式细胞术:待细胞长满单层后,以胰蛋白酶消化并反复吹打制成单细胞悬液,离心后去上清液,再用PBS液洗涤2次以排除培养液可能的干扰。
加入CD31PE20 l,充分摇匀,闭光孵育30min。
结合多抗的细胞加入FIT C标记的羊抗鼠多克隆稀释抗体,闭光15min后立即行流式细胞术分析,结果以荧光图表示。
设阴性对照组,不加一抗,其余操作相同。
FM 术检测vWF因子与CD31相似,一抗为抗人vWF抗体。
结 果一、倒置显微镜观察 原代细胞接种12h后开始贴壁,24h后大部分贴壁生长。
早期细胞球形、椭圆形及团块状,仅少数细胞伸展,48~72h后生长最快、变成梭形。
5~7d后融合,呈现典型的镶嵌状卵石样排列。
传代细胞的形态变化及生长方式与原代培养细胞类似,汇合后细胞也呈卵石样排列(见图1)。
图1 培养细胞倒置显微镜观察 二、流式细胞术鉴定内皮细胞 与对照相比,细胞表面的CD31表达荧光强度相似,表明培养细胞也有CD31表型存在。
vWF因子的荧光强度与对照相比无明显的差异,进一步说明培养细胞为血管内皮细胞(见图2)。
anti PECA M(CD31) anti vWF图2 培养细胞CD31和vWF因子荧光密度表达讨 论新生儿脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源,具有取材方便、操作简单易掌握、获得细胞多等优点,能够很好的满足基础和临床研究的需要。
国外Jaffe等人于1973年培养人脐静脉内皮细胞获得成功,我们则主要参考张宝庚等人的方法也培养成功,并通过细胞形态学、细胞生长特性、细胞表型和特异性分泌抗原证实。
血管内皮细胞的贴壁生长受诸多因素的影响,首先,是脐带离体时间的影响。
王建明等[1]人的研究表明,随时间延长离体脐带内皮细胞某些物质的含量会发生变化,6h至12h内皮细胞V因子相关抗原、前列环素呈下降趋势,程满根等[2]人研究表明脐带离体3h内内皮细胞存活率达90%,离体24h仅有50%存活。
一般实验时取足月分娩新生儿脐带,经简单的去除血迹等处理即进行消化培养。
其次,在内皮细胞获取方法上有:(1)离心分离法,主要用于血细胞等的分离。
(2)机械分散法,如Priebe等[3]使用带有尼龙筛的分离管刮取内皮获得细胞,体外培养成功。
(3)消化分离法,如胰蛋白酶、胶原酶及EDTA进行消化,一般很少混杂平滑肌细胞和成纤维细胞,我们应用胶原酶 获取足够内皮细胞,并且未见细胞污染。
第三,培养基质的影响,进口培养瓶因加入促细胞贴壁物质利于细胞生长而广泛应用,我们选用Falcon公司35cm2培养瓶效果满意。
同时预先于瓶底面铺加0.1%明胶蛋白(gelatin),它是一种变性胶原,具有良好的亲合性,能与许多细胞自然配位结合使细胞更容易贴壁生长,且具有很好的光学性质便于观察。
第四,培养液的影响,常用培养基DM EM、RPM I1640及M199均可用于内皮细胞的培养,但是必需加入血清,细胞才能更好地生长。
因为,血清含有供细胞生存所必需的生长调节因子,为培养液提供良好的缓冲系统,利于细胞贴壁和铺展等特殊作用,是一种优良的天然培养基。
实验中,我们加入10%胎牛血清(fetal bovine serum),从而使细胞在体外良好生长。
第五,传代对H UVEC产生很大影响,有人检测出随着培养代数的增加,细胞形态和功能发生明显的变化,传代2个月后不仅出现较多的#巨细胞∃,细胞群稀疏,透光度下降,最后死亡,而且在功能上分泌前列环素和vWF因子的功能逐渐下降、直至消失[4]。
另外,HU VEC的传代较困难,一般仅能传2~3代,为此我们于培养液中加入血管内皮生长因子(VEGF),后者对血管内皮具有特异的促有丝分裂作用,有利于多次传代培养。
第六,细菌、霉菌和支原体污染培养物也较常见,使培养细胞生理、生化、遗传学等方面发生变化,只能废弃。
对于细菌、霉菌和支原体污染,培养基中预防性的加入青霉素、链霉素和二性霉素,而支原体污染迄今尚无行之有效的方法。