微生物鉴定中常用的生理生化试验09级生科3班李雪彤（200900140061）同组者：刘雯雯、娄峰、潘红芳、朴薇一、实验目的1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。

2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。

3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。

4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

5.了解IMViC的原理。

二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

具体的原理如下：1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。

酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。

若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。

（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。

本次不做该试验。

（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。

三、实验材料1.菌种大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。

2.培养基固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。

3.溶液和试剂革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。

4.仪器和其他用品平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。

四、实验步骤1.制备培养基制备固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖培养基（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，制备方法见附录2.淀粉水解试验1.将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

2.用记号笔在平板底部划成4部分。

3.将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种，在平板的反面分别在4部分写上菌名。

4将平板倒置在37℃温箱中培养48h。

5观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。

透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。

3油脂水解试验1将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝。

2用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分标上菌名。

3用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别划接种于平板的相对应部分的中心。

4将平板倒置，37℃温箱中培养48h。

5取出平板，观察菌苔颜色。

如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

4糖发酵试验1用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。

2取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。

另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。

在接种后，轻缓摇动试管，使均匀，防止倒置的小管进入气泡。

3将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养48h。

4观察各试管颜色变化及徳汉氏小管中有无气泡。

5吲哚试验1用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基中，置37℃中培养48h。

2于培养48h后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

6甲基红试验1用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃中培养48h。

2培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。

五、实验结果1.大分子物质的水解试验（1）淀粉水解实验“+”表示阳性，可以水解淀粉，“—”表示阴性，不可以水解淀粉菌种阴 / 阳性结论大肠杆菌—不可以水解淀粉枯草芽孢杆菌+ 可以水解淀粉金黄色葡萄球菌—不可以水解淀粉铜绿假单胞菌+ 可以水解淀粉表1.淀粉水解实验结果（2）油脂水解试验菌种阴 / 阳性结论大肠杆菌—不可以水解油脂枯草芽孢杆菌+ 可以水解油脂金黄色葡萄球菌+ 可以水解油脂铜绿假单胞菌+ 可以水解油脂表2. 油脂水解试验结果2.糖发酵试验（1）葡萄糖发酵培养基样品大肠杆菌普通变形杆菌空白试管1 试管2 试管3 试管4 试管5颜色变化黄色黄色紫色是否产气是是否阴/阳性+ + —结论大肠杆菌可以分解葡萄糖，同时产酸产气。

普通变形杆菌能分解葡萄糖，同时产酸产气。

对照组图1.接种普通变形杆菌图2.接种大肠杆菌的图3.空培养基的葡萄糖发酵培养基葡萄糖发酵培养基（2）乳糖发酵培养基图4.接种大肠杆菌的乳糖发酵培养基图5.接种普通变形杆菌的乳糖发酵培养基 (左)和空白的乳糖发酵培养基(右)“+”表示产酸或产气，“—”表示不产酸不产气样品大肠杆菌普通变形杆菌空白试管1 试管2 试管3 试管4 试管5颜色变化黄色紫色紫色是否产气是否否阴/阳性+ ——结论大肠杆菌可以分解乳糖，同时产酸产气。

普通变形杆菌不能分解乳糖，故不产酸不气。

对照组表4.乳糖发酵培养基实验结果3.IMViC试验（1）吲哚试验样品大肠杆菌产气肠杆菌试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6是否产生红色物质是否阴性/阳性+ —结论大肠杆菌可以分解色氨酸为吲哚产气肠杆菌不能分解色氨酸为吲哚表5.吲哚试验结果（2）甲基红试验样品大肠杆菌产气肠杆菌试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6颜色变化变红变黄阴性/阳性+ —结论大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH 产气肠杆菌转化有机酸为非酸性末端产物表6. 甲基红试验结果六、思考题1．你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。

2．不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。

呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。

3．假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？答：由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。

德汉氏小管中有气柱。

4．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。

答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。

5．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。

对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。

七、实验小结通过本次实验我们证实了不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；了解了糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用以及IMViC 的原理；并掌握了微生物大分子物质水解实验的原理和方法以及通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

附录121℃灭菌20min 。

注：①不能使用变质油。

② 油和琼脂及水先加热。

③调好pH 后，再加入中性红。

④分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。

制法:⑴ 将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7.6）分装于试管中,在每管中放一倒置的小玻璃管。

⑵将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min ；糖溶液112℃灭菌30分钟。

⑶灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5mL(按每10mL 培养基中加入20%的糖液0.5mL ，则成1%的浓度)。

配制后的试管必须洗干净，避免结果混乱。

将上述各成分溶于1000mL 水中，调pH7.0~7.2，过滤。

分装试管，每管10mL ，112℃灭菌30分钟。