一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：
1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料
1.菌种
大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
2.培养基
固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基。
3.溶液和试剂
革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。
4.仪器和其他用品
平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。
四、实验步骤
1.淀粉水解实验
（1）培养基制备
将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）接种
用记号笔将平板划成四部分，分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在不同位置划线接种。
在平板反面用记号笔写上菌名。
（3）培养
将上述已接种的平板倒置于37℃培养箱中培养48小时。
2.油脂水解实验
（1）培养基制备
将溶化的油脂培养基冷至50℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平皿中，待凝。
（2）接种
用记号笔将平板划成四部分，分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄菌、铜绿假单胞菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的中心。
在平板反面用记号笔写上菌名。
（3）培养
将上述已接种的平板倒置于37℃培养箱中培养48小时。
3.葡萄糖发酵实验
（1）培养基制备
将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌。
（2）接种
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。
取盛有葡萄糖发酵培养
基的试管2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌。
（3）培养
将上述已接种的试管置于37℃培养箱中培养48小时。
4.乳糖发酵实验
（1）培养基制备
将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌。
（2）接种
记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。
取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌。
（3）培养
将上述已接种的试管置于37℃培养箱中培养48小时。
5.吲哚实验
（1）培养基制备
将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌。
（2）接种
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。
取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种产气肠杆菌。
（3）培养
将上述已接种的试管置于37℃培养箱中培养48小时。
6.甲基红实验
（1）培养基制备
将配制好的葡萄糖蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌。
（2）接种
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。
取盛有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种产气肠杆菌。
（3）培养
将上述已接种的试管置于37℃培养箱中培养48小时。
五、实验结果
1.大分子物质的水解试验
（1）淀粉水解实验
“+”表示阳性，可以水解淀粉，“—”表示阴性，不可以水解淀粉
表1.淀粉水解实验结果
（2）油脂水解试验
“+”表示阳性，可以水解油脂，“—”表示阴性，不可以水解油脂
菌种阴/ 阳性结论
大肠杆菌+ 可以水解油脂
枯草芽孢杆菌+ 可以水解油脂
金黄色葡萄球菌+ 可以水解油脂
铜绿假单胞菌- 不可以水解油脂
表2. 油脂水解试验结果
2.糖发酵试验
（1）葡萄糖发酵培养基
图1.接种普通变形杆菌的葡萄糖发酵培养基图2.接种大肠杆菌的葡萄糖发酵培养基
“+”表示产酸或产气，“—”表示不产酸不产气
样品
大肠杆菌普通变形杆菌空白
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 颜色变化黄色黄色紫色
是否产气是是否
阴/阳性+ + —
结论
大肠杆菌可以分解葡
萄糖，同时产酸产气。
普通变形杆菌能分解葡
萄糖，同时产酸产气。
对照组
表3.葡萄糖发酵培养基实验结果
（2）乳糖发酵培养基
图3.接种大肠杆菌的乳糖发酵培养基图4.接种普通变形杆菌的乳糖发酵培养基(左)和空白的乳糖发酵培养基(右)
“+”表示产酸或产气，“—”表示不产酸不产气
表4.乳糖发酵培养基实验结果
3.IMViC试验
（1）吲哚试验
表5.吲哚试验结果（2）甲基红试验
图5.接入大肠杆菌的葡萄糖蛋白胨水培养基图6.接入产气肠杆菌的葡萄糖蛋白胨水培养基
大肠杆菌产气肠杆菌样品
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 颜色变化变红变黄
阴性/阳性+ —
大肠杆菌在培养期仍维持酸性
产气肠杆菌转化有机酸为非酸性末端产物结论
pH
表6. 甲基红试验结果
六、思考题
1．你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2．不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。
呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。
3．假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
答：由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。
德汉氏小管中有气柱。
4．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。
七、实验小结
通过本次实验我们证实了不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；了解了糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用以及IMViC 的原理；并掌握了微生物大分子物质水解实验的原理和方法以及通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。