1.4.2 反向 PCR 引物
右边界
PCR assay is applicable to detect genetically modified maize and its derivates accurately, fast and efficiently, and can serve to
verify routine PCR qualitative detection.
Abstract：We report the cloning of two flanking sequence of the integrated gene construct of genetically modified maize 59122
by inverse PCR method and the design of even-specific primers based on the left flanking sequence with the aim of developing
DU 640 核酸蛋白分析仪 美国 Beckman Coulter 公 司；UV-2450 紫外分光光度计 日本岛津公司；GelDocIt 紫外凝胶成像仪 美国 UVP 公司。 1.2 制备不同转基因含量的 59122 玉米样品
将转基因玉米59122和其非转基因亲本按质量比相混 合，制成 6 个不同转基因含量(10%、5%、1%、0.5%、 0 . 1 % 、0 . 0 5 % ) 的样品。 1.3 基因组 DNA 的提取[3]
1.4.1 总 DNA 的酶切与酶切片段的环化 取约 1μg 基因组 DNA 加入 1 ×缓冲液和 10U 限制
性内切酶形成 60μL 的反应体系，选择在 ubiquitin 内含 子内部没有酶切位点的常用限制性内切酶 Sac Ⅰ和BamH Ⅰ 以及在 pat 基因序列中没有酶切位点的常用限制性内切 酶 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ，分别于 37℃消化玉米基因组 3h， 接着用酚 - 氯仿 / 异戊醇(Tris- 饱和酚:氯仿:异戊醇的体积 比为 25:24:1)抽提法纯化 DNA(除去由限制性内切酶释放 的短的寡聚核苷酸) ，最后将基因组 D N A 溶于 2 5μL ddH2O 中。此后向含约 16ng 经过消化的基因组 DNA 中 加入 1 ×缓冲液，6U T4 连接酶形成 50μL 反应体系，在 T4 连接酶的作用下于 4℃过夜连接成环。于 75℃处理 15min 后洗涤沉淀溶于 20μL ddH2O 中。
转基因玉米转化的主要改良性状为抗虫和耐除草剂 等[1,8]，转基因玉米 59122 兼具抗虫害及耐除草剂两种特 异性转化事件，是通过农杆菌介导技术将质粒载体 PHP17662导入玉米转化事件Hi-Ⅱ基因组筛选得到的基因 改造玉米。PHP17662 包含选自 Bacillus thuringiensis strain PS149B1 的 cry34Ab1 与 cry35Ab1(delta-endotoxin) 抗虫基因以及抗除草剂 pat(phosphinothric in-N acetyltransferase，膦酸乙酰转移酶)基因。
Event-specific Transgenic Detection of Genetically Modified Maize 59122 with Flanking Sequence
XU Wen-tao1,2，YANG Rong2，LU Jiao1，ZHANG Nan1,2，LUO Yun-bo1，HE Jing1,2，HUANG Kun-lun1,2,* (1. Food Safety Laboratory, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University,
This assay has been successfully applied to detect genetically modified maizes 59122, MON863, MON810, GA21, NK603,
genetically modified Roundup Ready soybeans and genetically modified oilseed rape GT73, with high specificity. The optimum
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 转基因玉米 59122 及其非转基因亲本 美国 DuPont
公司；转基因玉米 M O N 8 63、M O N 8 10、G A 2 1 、 NK603、转基因大豆 Roundup Ready、转基因油菜 GT73 孟山都公司；限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、dNTP 大连宝生物工程有限公司；Hind Ⅲ限 制性内切酶 美国 Promega 公司；RNase A 酶、DNA Marker DL 2000、CTAB、Tris、EDTA、IPTG、氨 苄青霉素等 美国 Sigma 公司；蛋白胨、酵母粉等制 备细菌培养基试剂 鼎国公司；DNA 回收试剂盒 北京 佰亿新创科技有限公司。
称取 100mg 于液氮中研磨成粉末状的种子材料，按 CTAB 法提取样品总 DNA。提取的总 DNA 溶于 30～50μL ddH2O 中，经核酸蛋白分析仪测定其浓度，最终稀释 成 100ng/μL 和 50ng/μL 备用。用紫外分光光度计测定 DNA 溶液的 OD260 与 OD280，并计算 OD260/OD280 的比值 来评价提取的质量，本研究中所用 DNA 其 OD 比值均在 1.6～1.9 范围。 1.4 反向PCR(I-PCR)
中图分类号：Q789；S513
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2011)04-0139-04
随着转基因作物的不断商业化，新型转基因食品的 安全性问题逐渐成为公众关注的焦点。为此，各国都 加强了管理[1]。除了向公众公布相关信息、增加透明度 外，关键问题是建立相应的科学检测方法来分析鉴别转
Key words：genetically modified crop；event-specific transgenic detection；semi-nested polymerase chain reaction；
inverse polymerase chain reaction；duplex polymerase chain reaction
本实验根据 GeneBank 中获得的 ubiquitin 启动子(登 录号 CS165465)和 pat(登录号 DQ156557)基因序列，利用 反向聚合酶链式反应(inverse polymerase chain reaction， I-PCR)来确定转基因玉米 59122 的侧翼序列。随后，在 侧翼序列相邻的 T-DNA(转基因载体)和玉米基因组上各 设计一条引物，此对引物就可以对该转基因玉米 59122 进行转化事件特异性检测。建立定性检测体系，并验 证该检测方法的特异性和灵敏度。
基因产品。 目前，转基因产品的检测技术[2]很多，分为基于核
酸水平的检测技术、基于蛋白水平的检测技术以及其他 检测技术。在定性检测中基于蛋白水平的检测[3]不能区
收稿日期：2010-03-13 基金项目：国家“8 6 3 ”计划项目( 2 0 0 6 A A 1 0 Z 4 4 0 )；国家自然科学基金项目( 3 0 8 0 0 7 7 0 )；
concentration of linear DNA in a connection system for detecting genetically modified maize 59122 by this assay was around 1 ng/μL, which exhibited a limit of detection of 0.1% and a sensitivity of 38 copies of haploid genome. Therefore, the developed
摘 要：使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米 59122 的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序 列，并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物，运用半巢式 PCR 技术建立了 59122 的品系特异性二重 PCR 检测方法，扩增片段 100bp，横跨 pat 终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米 59122、MON863、 MON810、GA21、NK603，转基因大豆 Roundup Ready 和转基因油菜 GT73 等为材料，证明本方法与其他转基 因作物具有高特异性。本方法在检测 59122 时，确定出连接体系中线性 DNA 的最佳质量浓度为 1ng/μL 左右，检 出限达到 0.1%，灵敏度为 38 个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品，或 作为常规 PCR 定性检测后的验证方法。 关键词：转基因作物；品系特异性检测；半巢式聚合酶链式反应；反向聚合酶链式反应；二重聚合酶链式反应
of a duplex PCR assay for the event-specific transgenic detection of genetically modified maize 59122 using semi-nested PCR,
result ing in an amplification fragment of 100 bp in length stretching from the terminator of the pat gene to the 59122 flanking genes.
Beijing 100083, China ；2. Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)