分发部门：质量部、中心化验室
生效日期：年月日
黄曲霉毒素测定法操作规程
1目的
通过制定黄曲霉毒素测定法操作规程，以确保检验的准确性。

2适用范围
适用于中心化验室所有的高效液相色谱法-柱后衍生法对药品的黄曲霉毒素测定。

3职责
必须由经过相应知识培训的QC人员方可进行黄曲霉毒素测定法的操作。

4文件内容
4.1简述
黄曲霉毒素可以由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉4种真菌产生，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物。

中药在贮藏、制备、运输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。

黄曲霉毒素是目前世界上已知的毒性最强电话化合物之一，其致癌性肯定。

对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证用药安全具有重要意义。

本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后衍生-荧光检测器检测进行分析测定。

用于测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计）。

4.2仪器及用具
4.2.1 高速匀浆器
4.2.2 高效液相色谱仪，配荧光检测器（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）
4.2.3 柱后衍生系统（碘衍生系统或光化学衍生系统）
4.2.4 离心机
4.2.5 超纯水处理系统
4.2.6 超声波提取器
4.2.7 固相萃取装置
4.2.8 离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。

4.3试药与试液
4.3.1 甲醇、乙腈均为色谱纯。

4.3.2 水为超纯水
4.3.3 黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，标示浓度分别为1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0µg/ml、
0.3µg/ml）
4.3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解用水稀释至1000ml即得。

4.4色谱条件及系统适用性试验
4.4.1 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相；柱温：40℃；采用柱后
衍生法检测（分为碘衍生法和光化学衍生法）；以荧光检测器检测，激发波长λem=360nm(或365nm)，发射波长λex=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

4.4.2 碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液，衍生化泵流速为每分钟0.3ml，衍生化温度70℃。

4.4.3 光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）
4.5操作方法
4.5.1混合对照品溶液的制备
精密量取黄曲霉毒素混合对照品1支（规格1.0ml/瓶），小心转移至20ml量瓶中，并用甲醇少量多次冲洗对照品瓶，洗液并入量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液（储备液黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，浓度分别为0.05µg/ml、0.015µg/ml、0.05µg/ml、0.015µg/ml）。

精密吸取储备液1ml，置25ml 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

4.5.2 供试品溶液的制备
取供试品粉末（过二号筛）约15g（除另有规定外），精密称定，加入氯化钠3g，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟）（或超声处理20min），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱，流速约每分钟3ml，用水20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品制备两份平行样品。

4.5.3 测定法：分别精密量取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，每个
进样量重复进样两次，测定峰面积，以峰面积平均值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。

另精密量取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，每份供试品溶液重复进样两次，测定峰面积并
计算平均值，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。

4.5.4 随行回收率：取供试品粉末（过二号筛）约15g（除另有规定外），加入与供试品黄曲霉毒素B1最
高限量等量的对照品溶液储备液（如陈皮供试品黄曲霉毒素B1限量为不大于5μg/kg，供试品取样量为5g，则加入黄曲霉毒素混合对照溶液储备液的量以黄曲霉毒素B1计为0.5ml），混匀挥干溶剂后，按
4.5.2供试品溶液的制备方法制备随行回收率测试样品，随行回收率结果范围参照章节4.6.5。

4.6注意事项
4.6.1 本实验应具有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

4.6.2 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装10%次氯酸钠溶液）内，浸
泡24小时以上，再用清水江玻璃器皿清洗干净。

实验室废液也需加入次氯酸钠进行处理。

4.6.3 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性，所以混合黄曲霉毒素对照品贮备液应配制在棕色容量
瓶中，并避光保存。

黄曲霉毒素对照品溶液则需临用新配，并注意避光。

4.6.4 当供试品溶液进样量超过20μl时，为包装获得良好的色谱峰峰形，供试品制备中最后可用水稀释至
刻度。

4.6.5 随行回收率：加标浓度＜1.0μg/kg，回收率应在50%～120%；加标浓度1μg/kg～10μg/kg，回收率
应在70%～110%
5参考文献
中国药典2010年版第二增补本
中国药品检验标准操作规范
6相关文件
GWQ1-700-022.00 高效液相色谱法操作规程
7附录
NA
8附件
NA。