卡拉胶降解菌的筛选
摘要：利用梯度稀释平板涂布的方法将经过富集的卡拉胶降解菌样品在涂布于
平板上，以卡拉胶为唯一碳源，在适宜的环境下培养，得到单个菌落，达到卡
拉胶降解菌的初步筛选的目的。
关键字：卡拉胶降解菌、初筛
前言：卡拉胶(Carrageenan)又名角叉菜胶、鹿角藻胶，是从红藻中提取的一种高分子亲水性多糖。
根据其乳糖残基上硫酸酯基团的不同，可分为K一型、c-型、A一型、弘一型等7种最小重复结构单位。
A一卡拉胶是一种高硫酸酯化的天然多糖资源，其降解产物A一卡拉胶寡糖的活性研究已得到充分的开展，如抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等[1]。
国内外的研究者从提取、结构、活性等方面对卡拉胶进
行了研究[2]。
而不同的卡拉胶具有不同的凝固性和表面活性，可用于凝固剂黏
合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂等，广泛用于食品工业。
[3]
正文：
一．器材：试管16支，玻璃涂棒一根，1ml移液管3支，酒精灯一个，培养皿24个，试管架，1个锥形瓶，烘箱，高压杀菌锅
二．试剂：K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O,FePO4·4H2O,CaCl2, H2O，NaNO3,NaCl卡拉胶，海水
三．步骤：
1.卡拉胶降解菌的初筛：
（1）无机盐母液配制： K2HPO4·3H2O: 2.2g , MgSO4·7H2O:
1.25g ,FePO4·4H2O: 0.025 g , CaCl2: 0.25g
然后溶于水中，共配制250ml; [4]
（2）培养基溶液配：NaNO3：0.7g , NaCl：5.25g ，卡拉胶：4.2g ，
溶于海水中，共配制350ml，并添加无机盐母液：35ml[5]
（3）预处理杀菌：取12支试管，用移液管分别向各试管中加入9ml海水，用报纸包好；同时用报纸将24个培养皿﹑ 3个1ml移液管﹑装培养基
液的锥形瓶﹑分别包好。
然后将培养皿﹑移液管放入烘箱，杀菌2h；将锥形瓶﹑试管放入高压杀菌锅在120摄氏度杀菌30min.
（4）倒制培养基：分别将大约15ml的培养基溶液倒入杀菌后的培养皿中。
冷却，制成培养基。
（5）样品稀释：用1ml的无菌移液管分别从原有6个样液中吸取1ml样液注入盛有9ml无菌海水的试管中，震荡混匀即为浓度为10-1，然后再用同一支
1ml 无菌移液管，从此管中吸取1ml注入另一盛有9 ml无菌海水的试管中即为浓度为10-2。
[6]
（6）涂布：在无菌环境下，先用1ml的无菌移液管从稀释度10-2的稀释液中吸取0.2ml 菌液，涂布于一些好标号的培养基平板内，然后吸取10-1的稀释液0.2ml涂布已写好稀释度的培养基平板上，室温下静置。
注意：移液管不可混用，始终对号实用。
（7）培养：将涂布好的培养基平板倒置于室温中，培养48h.
2.卡拉胶降解菌的富集:
用1ml的无菌移液管分别从含有纯原液的三个三角烧瓶中吸取0.2ml放入已标号并且加好所需培养液的试管中进行富集。
与平板一起在适宜的环境下培养48小时。
四．分析与讨论：
1：观察卡拉胶降解菌的培养情况，可以观察到较清晰的菌落，分别有小粉色斑点状菌落，乳白色菌落，较大的淡蓝色菌落，透明状菌落，深坑状菌落。
2：观察试管中卡拉胶降解菌的富集情况对试管富集情况进行排序。
排序结果：A2
B1,A1,B2,C2,C1
，
本实验中降解菌生长繁殖较好，出现了很明显的菌落，但是并不是单一的菌落，进一步的分离纯化还需要在此进行复筛。
参考文献：
[1] 周革非，魏元臣，孔娜娜等.λ卡拉胶降解组分的分离纯化、抗氧化及免疫
活性研究.海洋科学,2009年,第33卷,第8期
[2] 胡国华．功能性食品胶．化学工业出版社，2003．
[3] 杨玉玲,周光宏.卡拉胶凝胶质构特性的研究.食品工业科技.2008
[4]牟海津,江路，蒋萱等．卡拉胶降解菌M-2的筛选与产酶性质[J]．中国水产
科学，2002，9(3)：251—254，202．
[5] 段高飞,苏贝，韩峰等. 海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质
研究. 中国海洋大学学报（自然科学版）. 2010，40(3)
[6]大连海洋大学编.食品微生物学实验指导书.2009：17
实习日记
6月20日
卡拉胶降解菌筛选实验的资料查询与搜集
1，主要内容：
本组实验主要内容为就上一班同学富集的菌类利用梯度稀释，平板涂布的方法进行初筛，初筛出卡拉胶降解菌。
2：查找参考文献
3：确定实验方案
4：列出实验所需器材和试剂
5：了解实验的操作过程及注意事项
6月21日
进行卡拉胶降解菌的初筛与富集实验：
一，初筛：
器材：试管16支，玻璃涂布棒，移液管1ml三根10ml一根，酒精灯俩个，培养皿24个，试管架一个，三个锥形瓶，钥匙，记号笔，烘箱，高压杀菌锅，
试剂：K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O,FePO4·4H2O,CaCl2, H2O，NaNO3,NaCl 卡拉胶，海水
步骤：1:无机盐母液配制： K2HPO4·3H2O: 2.2g , MgSO4·7H2O:
1.25g ,FePO4·4H2O: 0.025 g , CaCl2: 0.25,H2O: 250ml;
2:培养基溶液配：NaNO3：0.7g , NaCl ：5.25g ，卡拉胶：4.2g ，海水：350ml，无机盐母液：35ml
3:灭菌：取12支试管，用移液管向各试管中加入9ml海水，用报纸将
24个培养皿﹑ 3个1ml移液管﹑装培养基溶液的锥形瓶﹑12支试管包起来将培养皿﹑移液管放入烘箱，杀菌2h,将锥形瓶，试管放入高压杀
菌锅杀菌15min.
4:倒平板：将适量的培养基溶液分别倒入杀菌后的培养皿中。
5:样品稀释：有6个样液。
用1ml的无菌移液管从一样品中吸取1ml样液注入盛有9ml无菌海水的试管中，震荡混匀（10-1），然后再用同一
支1ml 无菌移液管，从此管中吸取1ml注入另一盛有9 ml无菌海水的
试管中（10-2），其余样品同处理。
6：涂布：用一支1ml的无菌移液管分别从稀释度10-1﹑10-2的稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置。
7：将涂布好的培养基平板倒置于37℃恒温箱中，培养48h.
二，富集
用一支无菌1ml的无菌移液管从一个原始含沙粒的原液中吸取0.2ml对号放入已加好所需培养液的试管中进行富集。
另两个纯原液同处理，室温培养。
将涂布好的培养基平板倒置于37℃恒温箱中，培养48h.
6月24日
结果观察：
1：观察卡拉胶降解菌的培养情况，可以观察到较清晰的菌落，分别有小粉色斑点状菌落，乳白色菌落，较大的淡蓝色菌落，透明状菌落，深坑状菌落。
2：观察试管中卡拉胶降解菌的富集情况对试管富集情况进行排序。
排序结果：A2，B1,A1,B2,C2,C1
3：培养皿先高温杀菌，然后清洗干净。