实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察
一、实验目的：
1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：
1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面
2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿
3、仪器与材料：
生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉
三、原理：
微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用与细菌的单染色法基本原理一样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于同
一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。
芽孢壁厚，透性低、着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红）处理，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，则菌体和芽孢易于区别。
四、实验步骤：
（一）革兰氏染色：
1、涂片将培养14 —16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2、染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌做混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
（二）芽孢染色：改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。
目的：使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。
结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。
五、结果与分析：
1、绘图表示革兰氏染色结果。
2、绘出芽孢和菌体的形态图。
3、分析说明染色过程中的要点及注意事项。
六、思考题：
1、革兰氏染色的原理。
2、影响革兰氏染色结果正确性的环节？最关键环节？
3、芽孢染色的原理。
4、若涂片中观察到大量游离的芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，为什么？
5、不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？
6、当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
7、你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节?
8、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
9、如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
七、难点及重点：
重点：革兰氏染色法。
难点：革兰氏染色操作的正确性。
八、注意事项：
（一）革兰氏染色：
1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
因此必须严格把握脱色时间。
2、选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
3、涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应均匀，
4、水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。
水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
5、载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。
（二）芽孢染色法：
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。
2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。
3、用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
4、加热用水不宜过于剧烈沸腾，避免试管内染液烧干。
5、如果染液烧干，不能立即加入冷的染液。
6、制片和干燥时，温度不能过高，否则菌体变形。
九、课后总结：。