微生物学大实验实验指导编者:生物技术教研室200７。

3目录实验一酵母菌得培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌得鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥７实验三酵母菌耐受能力得测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件得优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2２实验五耐高温酵母菌株得诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥２７耐高温酒精酵母菌得选育及发酵条件得研究实验一酵母菌得培养与分离一、实验目得学习培养与分离酵母菌得技术与方法二、基本原理大多数酵母菌为腐生,其生活最适pH为4。

５－６,常见于含糖分较高得环境中,例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速,易于分离培养,在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境得特点,常用酸性液体培养基获得酵母菌得培养液(这样做得好处就是酸性培养条件则可抑制细菌得生长),然后在固体培养基上用划线法分离之。

三、实验主要内容与要求(一)本次实验得方案由同学们自己制定,实验包括:１.马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液得配制。

2、菌株得筛选,根据一定得生产目得并从特定得样品筛选出高产酒精得适宜得酵母菌株。

3。

酵母菌得分离,要求接种一次, 2８-３０℃,培养24小时,转接一次,２8－30℃,培养２4小时,并用镜检得方法独立判定所分离菌株就是否为酵母菌、4、用划线分离法对酵母菌进行纯化,要求每组挑取单个菌落,连续划线分离4代,镜下为单一纯菌株,每组扩繁10支斜面菌种,备用、四、实验得准备1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1％美蓝染液、1ml得无菌吸管、无菌培养皿等。

２、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:原料:马铃薯(２０0克)、葡萄糖(20克)、琼脂(15－20克)、蒸馏水(１000ｍｌ)。

配制方法:(1)先将马铃薯去皮,切片,称20０克并加蒸馏水10０0ml,煮沸半小时,用纱布过滤,补足蒸馏水量至1000mｌ ,制成2０%得马铃薯汁。

(2)在20%得马铃薯汁中加入琼脂,煮沸溶化,补足水分并在1１5℃条件下高压灭菌20分种。

(3)加入葡萄糖,制成培养酵母菌得马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

３、乳酸马铃薯葡萄糖培养液:配方同上,但不加琼脂而加乳酸,按每１000ｍl培养液中含５ml乳酸得量加入,并分装试管。

五、实验设计l、接种:取一小块果皮,不需冲洗,直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中,置28－３0℃,培养24小时,可见培养液变混浊。

2、培养,用无菌吸管取上述培养后培养液0。

ｌmｌ,注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,置２8一30℃再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。

3、观察:用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央得0、l％美蓝染色液中,混匀后加盖玻片制成水浸片,先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌得形态与出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原,从而使菌体不着色,用此方法可判断酵母菌得死活。

４、分离:马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板、用划线法分离酵母菌培养液,从而得到单个菌落。

挑取单个菌落反复再次划线分离纯化,最终可获得纯培养。

六、实验注意事项1。

配制培养基时,应注意琼脂得加量,不同规格及批次得琼脂得加量应由实验确定,不能照搬书上得加量、2。

对培养基加热时应注意琼脂得糊底与暴沸、3、灭菌锅操作时,首先应注意水一定要加足够,排气要彻底,其次灭菌期间不要离开人,灭菌结束后,关闭电源,拔掉插头,最后放气一定要缓慢,均匀,气放彻底才能开锅,取锅内物品,应小心,防止烫伤。

４。

接种前应注意无菌工作台得消毒与杀菌,接种时应注意手与接种工具得消毒。

七、实验结果得观察及记录1。

24小时,观察试管内培养液得情况并作记录,每组转接２支试管。

2。

4８小时,观察试管内培养液得情况,镜检培养液内菌得数量,粗略判断就是否为酵母菌并作记录,每人蘸取培养液进行划线分离,并作记录。

３、72小时后,观察培养皿内菌得生长得情况,挑取单个菌落进一步划线分离,直到为纯菌落。

４.每组转接10支斜面试管,备用、八、实验得延伸自然条件下酿造苹果酒,葡萄酒、猕猴桃酒。

七实验报告要求1、实验完毕后,每位同学都应独立作出实验报告,实验报告应类似于小型论文格式。

２、实验报告内容包括:(１)立题意义。

(2)实验设计、(３)实验步骤详细记录。

(4)对实验结果得分析讨论与总结。

(5)实验延伸。

(6)实验心得体会。

附１:果酒得酿制方法—、目得要求了解果酒酿制原理,学习苹果酒酿制技术。

二、基本原理果酒就是一类营养丰富、含酒精度低得上乘饮料。

它就是用含一定糖分与水分得果实压汁,经微生物发酵而成、其生化作用,除酒精发酵得主产物外,还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等得形成;同时,陈酿期中,各种酸类与醇类得酯化反应,赋予果酒特殊得香味;果酒中得单宁、色素、果屑微粒及蛋白质(包括酵母尸体)等得氧化与下沉,使酒液澄清、风味增浓。

各种果酒以原料而称名。

除坚果外,所有栽培果,野生果均可做酿果酒得原料。

本实验以苹果酒为例,学习其酿制方法。

三、实验材料１、菌种在７°Be’麦芽汁琼脂斜面培养基上得葡萄酒酵母(ｓ。

ceｒeviｓaｅｅｌlipsｏieleus)、2、器材苹果汁培养基,７°Be’麦芽汁培养基,10ｍl／管、１０0ml/三角瓶等装量,白糖,食用酒精,亚硫酸,果胶酶,发酵缸,破碎机,果汁分离器等、a。

苹果汁培养基粗滤新鲜果汁(蔗糖调至１3°Bｅ,酸度0。

5%以下)1000mｌＫ2ＨPO4 0.1ｇ MgSO4·7H2O 0.1g配好后,加热煮沸３～5分钟,静置1０小时以上,过滤、分装,0.７Kg／cm2灭菌２0分钟。

四、实验步骤(一)酒母培养1、菌种活化(一级种) 取装有10ｍl苹果汁或７°Ｂｅ’麦芽汁培养基1支,按无菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环,混匀后置28~30℃下培养2～5天(用苹果汁活化菌种时需培养5天以上),镜检酵母繁殖良好,无杂菌即可。

2、母发酵剂制备(二级种) 在装有100mｌ苹果汁培养基得三角瓶中,接1～２ml经活化得葡萄酒酵母菌液,于２８℃下培养２～３天,当培养液表面有气泡产生,嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。

3、生产发酵剂得制备(三级种) 方法与母发酵剂相同,只就是采取更大得容器。

一般采用5０0～100０ml得三角瓶或卡氏罐,盛装占容积１／2~3/５得果汁培养液,灭菌冷却后,按１0%接种量接人母发酵剂,在25～2８℃下培养24～48小时,待发酵正常,镜检无杂菌方可使用。

4、如果使用活性干酵母,添加量为20ｇ/Ｌ发酵醪,复水用水量就是干酵母重量得5～10倍、复水用水得温度应保持在4０℃左右(38~43℃),将酵母静置５~１０min后搅拌,酵母在水中得时间不能超过30min。

然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪得温差小于1０℃,然后直接加入发酵醪。

(二)果酒生产工艺流程如下:果胶酶↓苹果→分选除杂下清洗→破碎→压榨→粗果汁→果楂、苹果酸、丹宁↑活化酵母→母发酵剂→生产发酵剂↓蔗糖→发酵→皮渣分离→后发酵→原酒→→换捅除渣→贮存陈酿→配制→贮存→澄清过滤→装瓶→巴氏灭菌→封口→成品、(2~3次) 操作要点:1、分选取成熟苹果,除去腐烂、干疤与伤果。

2、清洗清水充分洗涤,除去果皮上得污物、杂质及药剂,以保证原料干净卫生。

3、破碎为易于压榨,提高出汁率,需进行破碎、用破碎机破碎至果块粒度0、5cm3左右,并除去果籽。

4、压榨分离破碎后立即进行压榨分离。

分离出得果汁中不得夹带果肉,同时需添加适量苹果酸调整含量(要求果汁总酸含量为５g／Ｌ),并加入0.1～0.15ｇ／L得果胶酶,促进果胶分解,使果汁澄清并提高酒得风味。

由于苹果汁易被自身含有得多酚氧化酶氧化,故需加SO2还原剂抑制酶活性,同时SO２也具有杀菌、防腐与澄清果汁作用。

ＳO2来源,除工厂应用液态ＳO2外,实验室常加入亚硫酸钠(Na2ＳＯ3)与偏重亚硫酸钾(K２Ｓ2Ｏ５),其用量为果汁量得0、02％即可、５、前发酵取澄清果汁放入经干热灭菌得发酵缸中,装量占缸容积得4／5,按３～5%得接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵,保持品温在1８～2２℃之间,最高勿超过25℃,发酵应在7～1２天内结束。

一般苹果汁糖分约为11%,经发酵后,酒精含量约达６％以上,前发酵结束后,原酒酒度应大于8％(V),残糖<２0g／L,总酸(苹果酸)>5g/L。

６、后发酵前发酵结束后,迅速将酒液与皮渣分离,酒汁转入经干热灭菌得发酵缸中,进行后发酵,使残糖继续分解。

期间,控制品温在18~22℃之间,不要超过25℃,时间1个月,即得原酒。

要求残糖含量小于2g／L以下,挥发酸(以醋酸计)小于０。

６g／L,总酸(以苹果酸计)大于5ｇ/Ｌ。

７、换桶除渣为使已澄清得原酒与其酒脚(沉淀物)及时分离,以免酒脚产生异味而影响酒质,故需进行换桶(缸)、换桶次数新酒每年换三次。

8、贮存陈酿应满桶贮存。

陈酿即酒得老熟,经长期密闭贮存,可使酒质澄清、风味醇厚。

贮存室温8~16℃,存期半年以上。

９、配制原酒贮存半年后可开始配制、配制时,按工艺规定将不同原酒按一定配比相混,然后添加适量得糖、酒精、继续贮存半年以上、10、澄清过滤可采用冷冻法使其澄清,即于-4℃左右存放7天,然后冷过滤。

澄清后得酒置-5～—7℃下冷冻３天不发生混浊沉淀,或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格。

11、装瓶灭菌装瓶后需进行巴氏灭菌,即在63℃下处理１5分钟,冷却后封口保存。

五、实验报告1、简述苹果酒得酿制法。

2、二氧化硫在果酒酿制中得作用就是什么?六、思考题1、酵母菌酿酒得原理就是什么？2、果酒酿制中为何要加入果胶酶？实验二酵母菌得鉴定酒精生产中所用酵母菌在微生物学中得分类依据就是什么？微生物学得类别分门、纲、目、科、属、种,生产酒精用酵母菌属于微生物中得真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。

酵母菌得分类依据就是根据它得形态特征、生理生化反应特征来确定得、在分类前将菌体细胞进行分离纯化,得到由单细胞长成得菌落,然后再进行形态特征与生理生化鉴定。

(一)形态特征得鉴定把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上,让它长成菌落,观察其菌落得形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。

把它再接种到液体麦芽汁培养基中,观察就是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环,培养液中就是否产生沉淀、混浊程度等。

另外,还要取样在显微镜下观察其单细胞得形态、大小、能否形成孢子、孢子得大小以及繁殖方式等。

(二)生理生化特征得鉴定酵母菌得生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类得能力。

同时,还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精,利用硝酸盐还就是硫酸盐,发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等得能力、最后,根据以上得出得形态特征与生理生化特征,查阅有关资料,把具有相同特征得一类酵母菌,就可以归属于某一属。