线粒体的分离————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实验三线粒体的分离、超活染色与观察一、实验目的1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。
2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
3、学习细胞器的超活染色技术。
二、实验原理利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
三、实验材料与方法1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。
2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。
温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。
四、实验方法（一）大鼠肝线粒体的分离1、制备大鼠肝细胞匀浆。
实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2、差速离心。
先将3ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入3ml肝匀浆使其覆盖于上层。
用冷冻控温高速离心机按图7-1顺序进行差速离心。
3、分离物鉴定。
(1)细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液（原液10－20倍稀释）染色10min。
自来水冲洗，吹干，镜检。
结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
(2)线粒体：取线粒体沉淀涂片（注意勿太浓密），不待干即滴加1%詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。
线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
分离细胞核鼠肝1克匀浆↓匀浆过滤↓滤液（制涂片一张①）↓将滤液3mL覆盖于相同容积的0.34mo l/L蔗糖溶液上↓700×g离心10mi n↓↓↓沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片②,自然干燥)↓洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液3mL洗涤两次）每次1000×g离心15min↓↓↓沉淀（细胞核）上清液2(与上清液1合并)分离线粒体混合上清液10000×g离心10↓↓↓沉淀（线粒体）上清液（弃去）↓洗涤，加0.25mol/L预冷蔗糖溶液6mL ,10000×g离心10min,重复洗涤两次↓↓↓沉淀（线粒体）上清液（制一张涂片，后弃去）（二）玉米线粒体的分离1、玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。
将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2－3d。
待芽长到1－2cm长时剪下下约15g，放0－4℃ 1h。
2、加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
3、用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。
除去核和杂质沉淀。
4、取上清液10000×g离心10min，沉淀为线粒体。
再同上离心洗涤一次。
5、沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中，注意以上匀浆化及离心均控制在0－4℃进行。
6、线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1%詹纳斯绿B 染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
（三）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1、取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
2、实验者用牙签钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10－15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
3、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。
可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。
（四）洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察1、用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10－15min。
2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展开，盖上盖玻片进行观察。
3、在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。
仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
五、作业与思考：1、将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
2、分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层？有什么作用？3、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。
4、用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体等多种细胞器？【资料】1、1%詹纳斯绿B染液：称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热（30－40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。
最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
2、0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)：0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）10ml；0.1mol/L盐酸8.4ml；加重蒸水到100ml；再加蔗糖使浓度为0.25mol/L；蔗糖为密度梯度离心用D（＋）蔗糖3、0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)：配方与前类似4、固定液：甲醇-冰醋酸（9：1）5、姬姆萨染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，纯甲醇33ml。
先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内钵磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。
用时吸出少量用1/15 mol/L磷酸盐缓冲液作10－20倍稀释6、1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）：1/15mol/L KH2PO4 50ml＋1/15mol/L Na2HPO4 50ml7、分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）、3mmol/L EDTA、0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tirs）溶液与42ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml9、、Ringer 溶液氯化钠0.85(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml10、10%、1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热（30－40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。