实验二细胞核与线粒体的分离与观察
一、实验目的
1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。

2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。

二、实验原理
细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。

线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。

细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。

对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。

差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。

在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。

在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。

依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。

缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。

整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。

线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。

从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。

分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。

介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。

EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。

牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
竞争性底物削弱蛋白酶的作用。

三、实验仪器、材料和试剂
1．材料
大白鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）。

2．试剂
动物细胞
（1）0.9 % 生理盐水
（2）0.02 % 詹纳斯绿B染液（用生理盐水配制）
（3）0.25 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）：0.1 mol/L 三羟甲基氨甲烷10 ml，0.1 mol/L 盐酸8.4 ml，加双蒸水到100 ml，加蔗糖到0.25 mol/L。

蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖
（4）0.34 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）
（5）固定液：甲醇︰冰醋酸（9︰1）
（6）姬姆萨染液：Giemsa 粉0.5 g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。

先往Giemsa 粉中加入少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h 令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。

用时吸出秒量用0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液作10～20倍稀释。

0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）：
0.067 mol/L KH2PO450ml
0.067 mol/L Na2HPO450ml
（7）1 % 甲苯胺蓝溶液
植物细胞
（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH 7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。

50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

（2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH 7.4）
（3）20%次氯酸钠（NaClO）溶液。

（4）1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。

3．器材。