原则
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质电泳 蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子 在等电点偏碱性溶液中，(SDS蛋白质电泳 使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) (PAGE)是一种利 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利 带负电荷，在电场中向正极移动； 带负电荷，在电场中向正极移动；在等
生物 西北农林科技大学 化学
动物科技学院生物化学课程组
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
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生物 化学
1 理化性质
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第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质的酸碱性质和等电点
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酸碱性质
分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
选择性沉淀蛋白质的方法 ： 1 理化性质 ①盐析法: 大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、 NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 (1) 酸碱性质 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数， (2) 分子量 蛋白质分子直径在1 100nm 之间， nm之间 蛋白质分子直径在 1-100nm 之间 ， 在水溶液 PEG、丙酮、乙醇等 (3) 胶体性质 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属 pH pI (4) 紫外吸收 不能通过半透膜） 不能通过半透膜） 离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： (5) 变性作用 水化膜； 同种电荷的互相排斥； ①水化膜； ②同种电荷的互相排斥； ③布郎 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时， (6) 化学反应 运动 蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 分离纯化 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件， 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件，影 子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 分析鉴定 酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
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1 理化性质
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酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
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1 理化性质
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第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
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1 理化性质
分离纯化
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第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
生物组织 前 4、浓缩与保存 1、前处理： 2、粗分级溶 解、差速离心 、 粗分级： 处 前处理： 破碎、 破碎、 ： 浓缩方法： 浓缩方法： 理 ①将组织和细胞破碎 细分级： 3、细分级： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 无细胞提取液 动物组织和细胞：NH4） 电动捣碎机、匀浆器、 动物组织和细胞（NH4）2SO4分级沉淀法、超 ：电动捣碎机、匀浆器 粗 透析除盐 ① ① 晶体保存： ①晶体保存： 声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液 声波处理植物组织和细胞：石英砂 提取液， 分 分离纯化蛋白质的一般原则 提取液， 盐析） （盐析） 选择性沉淀法 G-25凝胶过滤除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否 离 研磨、 研磨、 纤维素酶处理 ②等电点选择性沉淀法 分离和纯化蛋白质就是要增加制品的 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸 结晶不仅是纯度的一个指标， 结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 ③有机溶剂分级沉淀法 纯度或比活性。 纯度或比活性。 附层析、亲和层析、 附层析、亲和层析、疏水层析 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓， 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容 溶菌酶处理（分解肽聚糖） 粗分级、细分吸附 分解肽聚糖） 亲和 、 溶菌酶处理（离子交 前处理、粗分级疏水 电泳 自由界面电泳、区带电泳（ 一般流程为： 凝胶 区带电泳（凝胶 一般流程为：前处理、 电泳法： ④热处理选择性沉淀法 电泳法 易结晶。 易结晶。：自由界面电泳、 换层析 层析 ②差速离心法收集细胞的某一组分 层析 层析 过滤 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、。 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态细丝电 细 级、浓缩与保存 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性 在不同离心力下沉降的细胞组分 分 盐析、加有机溶剂、调节、双向电泳 。 沉淀法 泳等）、盘状电泳、等电聚焦、 ）、盘状电泳 泳等）、盘状电泳、等电聚焦pH 接入晶种。 pH、 度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种 离如果提取膜蛋白： ③如果提取膜蛋白： 离心法： 离心法：密度梯度离心 冻干粉保存： ②冻干粉保存： 超声波或去污剂使膜解聚， 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介 精制后蛋白质保存 溶液保存： ③溶液保存： 质提取。 质提取。 加入抗冻剂（50%甘油 甘油） 20～ 70℃保存 保存。 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。
原则
方法
分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质分离纯化常用方法的依据
根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离 选择性吸附分离（物理吸附） 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异
原则
方法
①利用差异 ② ③ ④ ⑤
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收
变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
化学反应
黄色反应，由硝酸与氨基酸的苯基（酪 黄色反应， 由硝酸与氨基酸的苯基（ 氨酸和苯丙氨酸） 氨酸和苯丙氨酸 ） 反应生成二硝基苯衍生 物而显黄色。 物而显黄色。 多肽的双缩脲反应：双缩脲是两分子的尿 素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双 双 缩脲能够与碱性硫酸铜作用， 缩脲能够与碱性硫酸铜作用 ， 产生兰色的 双缩脲络合物， 称为双缩脲反应。 铜 - 双缩脲络合物 ， 称为双缩脲反应 。 含 有两个以上肽键的多肽， 有两个以上肽键的多肽 ， 具有与双缩脲相 似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生 似的结构特点， 也能发生双缩脲反应， 成紫红色或蓝紫色络合物。 成紫红色或蓝紫色络合物 。 这是多肽定量 测定的重要反应。
沉淀 电泳 层析 离心
⑥ 膜分离
分析鉴定