2.3 电泳胶的浓度及其配制： 配制 100ml 1％TAE 琼脂糖电泳胶：在 100ml TAE 缓冲液中，加入 1g 琼脂糖，加热至
沸腾，待冷却到 40℃左右时加入 1ul EB 荧光液。 2.4 上样缓冲液：0.25％溴酚蓝和 40％（w/v）蔗糖水溶液混合成，存于 4℃。 3、 实验方法 3.1 SDS 碱裂解法制备质粒 DNA：小量制备 （1）挑转化后的单菌落，接种到 2ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB），37℃，200-300rpm
1
终止子）、衣藻转化载体 p124（带有 ble 基因，使宿主细胞具有腐草霉素和 Zeocin 抗性）、
大肠杆菌菌株（E.coli）XL1 由本实验室保存；
E-gfp 质粒（携带有 e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠。
1.2 衣藻材料
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii cc-849）由香港城市大学植物分子生物学与环境
SIGMA aborzentrifuge GmbH
机
电子天平
AB204－E
梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
电泳仪
PowerPac 300
Bio－Rad Laboratories，Inc.
PH 计
320－S PH 计
梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
高压消毒锅
SA－300VA
新骏实业股份有限公司
光照培养箱
3
（4）Add 1 ul T4 DNA ligase(vial 3) （5）充分混匀 （6）16℃，过夜
3.5 一步法制备感受态细胞并进行转化 （1） 吸取 1ml OD600 约 0.5～0.6 的细菌到 1.5ml 离心管中，4000r/min 离心 5 分钟，彻底
去除上清。 （2） 加入 0.1ml 冰水预冷的 SSCS Solution 轻轻悬浮菌体，可立即转化或冻存于－70℃待
沉淀回收 DNA 后再进行第二酶酶切反应。 3.3 胶回收
用试剂盒从 Agarose 胶中回收 DNA，试剂盒购自 TaKaRa，方法参照 PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0 说明书 3.4 连接 用快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit） 载体 DNA 和插入片断按 1：3 的摩尔比加入，所加入 DNA 的最大量不要超过 200ng。 （1）10ulDNA(载体与插入基因) 溶于 1×conc. DNA 稀释缓冲液 （2）再加入 10ulT4 DNA 连接缓冲液(2×conc.)(vial 1) （3）充分混匀
其他：氯化钙、氨苄青霉素、饱和酚、氯仿、氧化铝等为国产，有关化学试剂，均为
分析纯或分子生物学级（Molecular biology grade）。
1.4 主要仪器设备
仪器
型号பைடு நூலகம்
制造商
离 大型离心机 2K15G Refrigerated Centifuge
心 小型离心机
1-13 Laboratory Centrifuge
对于大量制备，可相应增加 SSCS Solution。重悬后的细胞应分装成 50～100ul，然 后储存于－70℃。 3.6 e-gfp 基因衣藻表达载体的构建 3.6.1 克隆载体 p105G 的构建 E-gfp 质粒（携带有 e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠，为了得到实验所需量的质粒， 现将 E-gfp 质粒转入到感受态菌株 XL1 blue 中，挑取单克隆进行摇瓶培养，大量扩增 e-gfp 基因，并通过 SDS 碱裂解法提取 E-gfp 质粒，凝胶电泳检测并定量。 通过 NotI 进行酶切 E-gfp 质粒后，加 Klenow 片断补平，并用酚氯仿抽提， 乙醇沉淀 过夜。离心收集沉淀并用去离子无菌水溶解，再用 SmaI 酶切，经电泳分离得到 e-gfp 基因 （大约 740bp），并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收。 用 PmacI 酶切 p105 质粒，经电泳分离得到线状的 p105 质粒，并用试剂盒从琼脂糖凝 胶中回收质粒。 插入片段（e-gfp 基因）和载体（p105）按 3：1 的摩尔比连接过夜，然后转化大肠杆 菌 E.coli XL1 中，通过酶切分析和 PCR 筛选出转化子，得到重组质粒 p105G。 3.6.2 表达载体 p105G124 的构建 筛选得到的阳性重组子 p105G 经大量扩增培养后，用 SDS 碱裂解法提取质粒，并用 EcoRI 酶切 p105G，经电泳分离并回收 e-gfp 基因的表达框架（约 1.7kb）。 插入片段（e-gfp 基因的表达框架）和载体（p124）按 3：1 的摩尔比连接过夜，然后 转化大肠杆菌 E.coli XL1 中，通过酶切分析和 PCR 筛选出转化子，得到重组质粒 p105G124。 3.7 衣藻的转化 通过“珠磨法”将外源基因转化到衣藻中，即将含有 e-gfp 基因的表达载体 p105G124 转入到衣藻细胞中，并在含 Zeocin 抗性平板（20ug/ml）上进行筛选。 （1）CC-849 在连续光照下，在 TAP 培养液中培养至对数期，细胞数约为 1－2×106 cells/ml。 （2）5000rpm,室温离心 5min，收集 CC-849。 （3）弃上清，用灭过菌的 TAP 培养液重悬沉淀，调整细胞浓度至 2×108cells/mL （4）吸取 300ul 悬浮液到 5ml 的试管里（里面有灭过菌的石英砂）。 （5）目的 DNA p105G124 用 NotI 酶切成线状，取 1μg 加入（4）中的试管中，同时建立一 个不加目的 DNA 的对照组（CK）。（注：目的 DNA 可以用 CsCl2 梯度离心法或试剂盒 提取）。 （6）把 CC-849/石英砂/外源 DNA 混合物在振荡器上以最高速度振荡 15 秒。 （7）把混合物转移到 25mL 的带螺旋帽的离心管中，加入 10mL 灭菌 TAP 培养液，在 100rpm 摇床过夜培养（18℃），让细胞恢复。 （8）3000rpm，室温 5min，收集细胞。 （9）弃上清，用 0.5mL TAP 缓冲液小心重悬，加入 3.5mL0.5％TAP 培养基，混匀后倒在 TAP 平板上（含 20μg /ml、Zeocin） （10）静置待凝固，倒置平板，放在 22℃光照培养箱里培养 3 周，待平板上长出绿色的单 克隆。 3.8 衣藻 DNA 的提取 （1）取 20m1 处于对数生长后期的衣藻培养液．4℃，5000r／min，离心 5min，收集细胞。
散均匀，然后冰浴 3－5min。 （6）4℃、15000r/min、离心 5min，将上清转移到另一离心管中。 （7）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提， 4℃，15000r/min，离心 2min，将
上清转移到另一离心管中。
（8）加入两倍体积无水乙醇沉淀 DNA，－20℃冰箱沉淀 1h 以上； （9）4℃、15000r/min、离心 5min 弃上清，用冰预冷的 70％乙醇 1ml 洗涤 DNA 沉淀，弃
生物技术实验室提供，属细胞壁缺陷株。
1.3 主要试剂
限制性内切酶、klenow 片断、去磷酸化酶、T4 连接酶；质粒提取试剂盒、PCR 片断回
收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0）、DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation
Kit）、DNA 片断纯化试剂盒（DNA Fragment Purification Kit）、RT-PCR 反应试剂盒；DNA
上清，倒置于滤纸上，使乙醇完全挥发，直至试管内没有看见的液体存在。
（10）溶于 20ul 无菌水或含有去 DNA 酶的 RNA 酶的 TE 溶液。 （11）通过电泳鉴定该质粒是否为目的质粒以及判断质粒的纯度。 3.2 限制性内切酶酶切反应 （遵照所购试剂说明书）
(1) 据实验需要取一定量的 DNA，加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液、无菌去 离子水，使反应体系中的甘油浓度<5%.
摇床上培养过夜。
（2）取 1.5ml 菌液至 EP 管(1.5ml 离心管），4℃、13000r/min、30sec 离心收集沉淀。 （3）弃上清，尽可能吸干培养液，加入预冷的碱裂解液Ⅰ100ul，剧烈振荡。 （4）加入 200ul 新配制的碱裂解液Ⅱ，颠倒 4－5 次，以混合内容物，切勿振荡！冰浴 10min。 （5）加入 150ul 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分
Marker（λDNA/EcoRⅠ＋HindⅢ）、DL 2000、ExTaq Mix（dNTP、Taq 酶、缓冲液）等均购
自 TaKaRa 生物（大连）有限公司）。
PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；
DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）购自 Roche 公司
Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司；
MJ Research
紫外分光光度计
Ultrospec 2000
Pharmacoa Biotech
荧光分光光度计 F－4500FL Spectrophotometer
HITACHI
2、 主要试剂的配制或成分
2.1 衣藻培养基：
培养基名称
TAP
Tris min
HSM
H2O Tris 4×Beijerinck salts
增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）
在莱茵衣藻中表达的研究
（生命科学学院，生物工程系生物技术专业 吴锦霞） （学号：2000302055）
内容提要：通过构建增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）衣藻表达载体，利用“珠磨法” 将 e-gfp 导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（CC-849）中，经 Zeocin 抗性筛选出转 e-gfp 基因衣藻； 在光照下培养转基因藻，经 PCR 和 RT-PCR 对转基因藻进行分子检测，结果表明 e-gfp 已经 稳定整合到莱茵衣藻基因组中，并具有转录活性；随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转 e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。