荧光蛋白基因实验胡建江，王安博实验一质粒DNA的提取目的及意义：1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
实验原理：溶液I（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA-Na、25mmol/L pH=8.0Tris-HCl）可以分散细胞，螯合金属离子可以使酶失活，防止DNA的降解；溶液II(0.4mol/L NaOH与2%SDS临用前1:1配用）可以使细胞在溶液中降解时，蛋白质与染色体DNA发生变性；溶液III （5mol/L醋酸钾30ml、5mol/L冰醋酸 5.75ml、5mol/L双蒸水14.25ml）使得酸性条件下质粒DNA复性，留在上清液，而DNA和蛋白质—SDS复合物等发生沉淀。
实验用品：1.仪器（恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、10uL+100uL+1000uL 微量移液器各一支、台式高速离心机、制冰机、混合漩涡器。
）2.材料（事先培养好的含目的基因质粒的菌液、1.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器及取液器吸头、三角瓶、量筒、试剂瓶等）3.试剂（LB培养液：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、pH=7.5；溶液I/II/III；50mg/ml卡那霉素贮存液工作浓度50ug/ml；100mg/ml 氨苄青霉素贮存液工作浓度100ug/ml；抽提液：饱和酚：氯仿：异戊醇+25:24:1 作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离，饱和酚密度大，可使DNA在上清液中，异戊醇防止抽提液气泡；无水乙醇作用:除去DNA水化层，使DNA沉淀；70%乙醇作用：纯化质粒DNA；含RNA酶的ddH2O 作用：溶解DNA）实验步骤：将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素），37摄氏度培养过夜取培养菌液1.5mL置EP管中，10000rpm，2min，弃上清液后，此步骤重复一次，弃上清液加入100uL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min加入200uL新配置的溶液II，轻轻翻转2-3次，使之混匀，冰上放置5min加入150uL冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min10000rpm 5min，取上清液于另一干净的离心管中向上清液中加入等体积（约400uL）的抽提液，振荡混匀，10000rpm 10min，将上清液转移至新的离心管中加入等体积（约370uL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min，取上清液于新离心管中向上清液加入其2倍体积无水乙醇，混匀，-20摄氏度放置30min 12000rpm 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体加0.8ml70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min加20ul含RNA酶的ddH2O，-20摄氏度保存备用注意事项：1.饱和酚（取下层）单独吸，氯仿：异戊醇（24:1）吸；2.制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈震荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用；3.在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。
实验二质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验原理：在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋>线状>开环。
但有时也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量相关。
实验用品：1.仪器：电泳仪、电泳槽、样品槽模板（梳子）、有机玻璃内槽、水平仪、取液器、微波炉、凝胶成像系统。
2.材料：提取的质粒溶液、琼脂糖、锥形瓶、一次性手套、胶铲、封口膜、剪刀、取液器吸头。
3.试剂：Gold view（DNA染液）、1 X TAE缓冲液、上样缓冲液（6 X Loading Buffer）。
实验步骤：1.琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30ml 1 X TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却至65摄氏度（不烫手为宜），加入1uL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
2.加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1 X TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA 5uL与1uL Loading Buffer(6X)混匀，加入胶板上的样品孔内。
3.电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边缘约1-2cm处，停止电泳。
4.观察和拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
实验三 PCR扩增实验原理：PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火（复性）--延伸三个步骤。
实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50uLPCR反应体系一个：反应物体积（uL）ddH2O 3410 X Buffer 5MgCl2 34X dNTP 2正向引物 1反向引物 1Taq酶 1质粒DNA模板 32.混匀后瞬时离心；3.放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min；②94℃变性30S；③55℃退火30S；④72℃延伸60S；⑤重复步骤②-④30次；⑥72℃延伸10min；4.取5uL反应液加1uL 10x loading buffer做电泳检测，分析所有目的片段的大小。
实验四酶切实验实验原理：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
PCR是在生物体内进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火--延伸三个步骤，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
选择质粒pET-28a作为载体的原因：pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。
宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。
充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
实验用品：1.材料：实验一提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套；2.试剂：NotI，BamHI，ddH2O,10xBuffer，引物，琼脂糖，Gold view；3.设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱。
实验步骤：1.分别取两支0.2mlEP管做上标记；2.两个EP管中分别配置下列的30uL体系：①号EP管②号EP管水9uL 水9uL 10xBuffer 3uL 10xBuffer 3uL NotI 1uL NotI 1uLBamHI 2uL BamHI 2uLpET-28a 15uL pEGFP-N3 15uL3.将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h；4.取5uL①②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果；5.按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
实验五 DNA的连接重组实验原理：①连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构；②：连接反应温度：理论上讲，连接反应的最佳温度是37℃，此时脸姐妹的活性最高。
但37℃粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12-16℃。
此时既可以最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定。
本实验选择16℃。
实验用品：1.材料：酶切后的EGFP、RFP和pET-28a、0.2mlEP管、取液器吸头、一次性手套；2.试剂：T4DNA连接酶、ddH2O、T4DNA连接酶buffer；3.设备：移液器、台式高速离心机、PCR仪。
、实验步骤：1.在EP管中分别配置下列的体系：0.2mlEP管10xBuffer 2.5uL酶切后的pET-28a 7.5uL酶切后的荧光基因片段13uLT4DNA连接酶（考虑连接效率）2uL（X：Y=1:10-30.总体积25uL）2.EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃下保存用于转化。
实验六重组质粒转入DH5α扩增实验原理：重组DNA分子的转化原理：细菌处于容易吸收外缘DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA 复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp等）得到表达。
在选择培养基上进行重组子的鉴定。
实验步骤：1.取出感受态细胞DH5α让其在冰上自然解冻，每200uL解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min；2. 42℃热冲击90S，立即置于冰浴5min；3.再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37℃摇床中培养1h；4. 1h后，6000rpm 3min，去掉上清液（约留200uL的培养液），摇匀菌块；5.用玻璃涂布器将溶液混匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜；6.第二天早上观察结果。
实验七菌落PCR鉴定实验原理：PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火--延伸三个步骤组成：高温变性：94℃下DNA双链解旋为单链；低温退火：55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；中温延伸：72℃时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5’到3’方向，复制模板的互补链；按此循环，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
实验用品：1.材料：DNA模板，4xdNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA，吸头；2.试剂：10xBuffer，15mmol/L MgCl2，T7启动子正向引物：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’,T7启动子反向引物：5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’；3.仪器：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统。