绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆
南方医科大学
学院
摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳 定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含 有目的基因 GFP 的 pEGFP-N1 质粒和 pMD18-T 载体进行酶切、电泳、回收、连接、 转入、筛选之后，把 GFP 基因成功导入到大肠杆菌 DH5α (克隆菌)中，从而实现 荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白 克隆 表达
3.
重组 DNA 的转化
1) 预先制备好感受态细胞。 2) 转化 DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验
实验组：10 l PCR 产物/蓝白 T 载体连接产物+ 100 l 感受态细胞 阳性对照组：10 l Control Insert DNA/蓝白 T 载体连接产物+100 l 感受态细胞 阴性对照组：10 l 无菌双蒸水 + 100 l 感受态细胞 步骤：（分别制作 3 组）将 10 lDNA 和 100 l 的感受态细胞加入试管中→冰浴 30min
④ 4 ℃ 保温
3) 琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒 凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上 样（1mlPCR 产物，6 l loading buffer 混合点样）→点 marker→电泳→取出凝胶→ 拍照
2.
构建重组 DNA
使用即用型蓝白 T 载体和快速 DNA 连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功， 设置对照组实验
空柱离心
13000rpm,2min
放入一个干净的离心管 中，在吸附膜的中间加 40μl 洗脱液
PCR 扩增目的基因 GFP
离心
13000rpm,1min
PCR 扩增 / -20℃保存备用
取 0.2 ml PCR 反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种 试剂换一个新吸头)：
H2O 质粒 DNA（pEGFP-N1）
6l 2l
引物 GFP1 (10 M)
1l
引物 GFP2 (10 M)
1l
Premix Taq
10 l
总体积
20 l
加完试剂后，将 PCR 反应管放到 PCR 仪上。
PCE 参数设置：
① 94℃预变性 5 分钟后开始以下循环
② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒
30 循环
72℃ 1 分钟
③ 72℃ 7 分钟
实验名称
2015- ~ 实验日期
2015-
合作者
绿色荧光蛋白的基因克隆 实验地点 指导老师
评分
教师签名
批改日期
一、 实验目的
1. 学习使用限制性内切酶进行 DNA 酶切的原理和方法。 2. 学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3. 掌握 PCR 技术原理和 PCR 仪的操作方法。 4. 学习 PCR 产物的 TA 克隆的基本原理和操作步骤。 5. 了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及 DNA 转化大肠杆菌的原理和方
颠倒数次
加 350μl 溶液 S3
颠倒数次 放置 3-5min
离心 13000rpm,10min
取上清 600μl 加到吸附柱中
离心 13000rpm,1min
离心
离心
弃滤液，加入 600μl 洗涤液 W
弃滤液，加入 600μl 洗涤液 W
13000rpm,1min
13000rpm,1min
弃滤液
2)
→42℃水浴精确 90s→迅速转移至冰浴冷却 1-2min→加入 800 lLB 培养基→恒温 培养箱中 37℃培养 45min
3) 检测重组 DNA：涂布平板筛选 步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素（Amp、X-gal、IPTG）的 LB 固体 平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿 37℃培养过 夜。
4.
重组 DNA 的筛选
培养的菌落在筛选培养基中，白色的菌落含有重组体 pUC18，蓝色菌落则没有或只有载体 pUC18。 挑选白色单菌落扩大培养： 用接种棒在白色单菌落上挑取菌落，接种于 4mlLB/Amp+培养液中，37℃震荡培养过夜。
5.
重组 DNA 的鉴定
从扩大培养的菌液中提取重组质粒 DNA，再进行限制性内切酶酶切，经行琼脂糖凝胶水平
法。
6. 掌握双酶切法鉴定重组 DNA 的基本原理和操作步骤，以及菌落 PCR 鉴定重组 DNA 的基本原 理和方法。
7.
掌握 IPTG 诱导 GFP 基因表达的基本原理和操作步骤
二、 实验原理
1.
pEGFP-N1 质粒
2.
T 载体
三、 材料与方法：
1.
实验材料：
质粒：pEGFP-N1 T 载体：pUCm-T 菌种：DH5 (克隆菌) PCR 引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56
电泳。进行对照实验。
步骤：
扩大培养的菌液
12000rpm
菌体沉淀
1min
250 l 溶液 S1
剧烈震荡
2.
方法
ห้องสมุดไป่ตู้
分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、 转化子
四、 实验具体流程
1.
获取外源基因
1) 碱裂解法提取质粒
使用 Axygen 质粒提取试剂盒
菌液
离心 1300r pm,1min
瞬时离心 弃上清
彻底弃上清
加 250μl 溶液 S1
漩涡震荡 悬浮沉淀
加 250μl 溶液 S2
实验试剂：
即用型蓝白 T 载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速 DNA 连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen 质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG 等
实验仪器：
超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机， PCR 仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、 超低温冰箱等
实验组①
对照组②
即用型蓝白 T 载体
1l
1l
PCR 扩增产物
1l
—
Control Insert DNA
—
1l
快速连接缓冲液 (2X)
5l
5l
超纯水-ddH2O Rapid T4 DNA ligase
2.5 l 0.5 l
2.5 l 0.5 l
总体积
10 l
10 l
添加完成后，冰箱内 16℃反应 45 分钟