3.基因诊断： 是DNA芯片最具商业价值的应用：诸多疾病如癌症、遗
异，而参与叶绿素合成的CABⅠ基因在叶组织较根高
500倍。
De Risi和Wodicka等用包含所有酿酒酵母基因在内的 DNA微阵列，观察了整个酵母基因组在发酵和呼吸反应 过程中各基因表达的动态变化。
水稻全基因组寡核苷酸芯片杂交
芯片上的亮点表示基因组 相应位置存在转录，亮度 越强转录活性越强。杂交 探针分别来自RNA样品： 水稻花序(红色)和悬浮培养 细胞(绿色)。
绿色代表下调；红色代表上调 ；黄色无差异。
公司
排阵方法
结果读出
主要方向
单片照相平板印刷法在
Affymetrix(Sa nta Clara.CA)
1.25cm2或5.25cm2薄硅片上合 成20～25mer寡核苷酸
荧光
表达图谱，多态性分析， 诊断。
Brax(Cambrid 短合成寡核苷酸，离片合成 质谱仪 )
5.数据收集与分析： 将荧光或激光共聚焦扫描得到的图像输入计算机，根据
研究目的用专门软件对数据进行自动化处理和定量分析。 基本步骤为：样品斑点确定、图像背景识别及扣除，数
据经正态化后统计分析，得出所需结果。
基因芯片的扫描：基因芯片杂交结果要用专用的扫描系 统读取。
膜芯片
石奕武，胡维新等：多发性骨髓瘤的基因表达谱分析， 湖南医科大学学报，2003，28(3)：201－205。ຫໍສະໝຸດ 可靠性 字读，易有漏读、错读
句读，错读较少
最佳适用 再测序，查明点突变
比较分析
基因芯片的发展
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
20世纪60年代用于抗体的免疫阵列(Imm unoarrays)技术 出现，80年代后期(1987，美阿贡国家实验室)开始出现 了用于基因诊断及检测的微阵列。
此后许多公司开始介入，综合运用多种技术，陆续研制 出中等密度、高密度芯片，检测方法趋于成熟。
1999年，中国将芯片技术列入“863 高科技计划”，启 动了相应的研究。2003年开始投资两亿多人民币在清华 大学建立基因芯片研究中心。
目前，基因芯片检测已成为大多数实验室都可利用的有 力工具。芯片密度已达40万个探针/芯片，探针间的空 间尺度是10~20微米。
➢ 合成后点样：探针合成后手工或机械法按点阵排列固定 于支持物上(有压电打印和直接点样两法)。
➢ 探针的固化：打印探针后需要将其固定在支持物表面， 同时也要封闭支持物上未打印区域，以防止核酸样品的 非特异性固定。
针式点样 玻璃片基处理后，以点样针沾取探针溶液，将探针点到
玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形 成共价键。 针式点样的优缺点： ➢ 优点：成本低，操作简单，密度高(几千~几十万点/cm2)， 转移过程中探针溶液损失小。 ➢ 缺点：定量准确性、重现性不好。
二级结构。
肽核酸( peptide nucleic acid, PNA)：是以氨基酸替代糖磷酸主链的DNA类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰 胺键相连构成，碱基通过甲叉碳酰基与骨架相连。
➢ PNA分子内不会形成二级、三级结构。 ➢ DNA与PNA杂交不需要盐离子。
4.杂交和检测： 多态性分析或基因测序杂交条件要求严格。 表达检测需要较长的杂交时间，较高的样品浓度及较低
2202芯片点样仪
生产商：Bio-Rad。
分辨率：1.25μm(x，y轴) 和0.25μm(Z轴)；重复性： 3μm；球面精确性： l0μm；一次制成芯片数： 126块芯片；每块玻片点 样量>82,000个点。
2.探针制备： 通常采用cDNA，RT-PCR过程中用同位素或化学荧光分
子标记。 荧光标记无辐射污染，通过激光共聚焦扫描分辨力好、
Synteri(Fremont.CA)
500～5000nt cDNA打印下 于～4cm2玻璃片上
German Cancer Instiute(Hedelberg.Germ any)
用f-moc或t-moc化学在片 (原型PNA巨片)合成
结果读 出
荧光
荧光
质谱仪
荧光 荧光/质 谱仪
主要方向
诊断，短片段串联 重复序列鉴定
基 因 芯 片 结 构 示 意 图
基因芯片种类
狭义：DNA芯片(DNA Chip)。 广义：生物芯片(biochip)、生物阵列(Bioarray)、微阵
列(Microarray)、DNA芯片(DNA chip )等。 按用途分为：样品制备芯片、生化反应芯片、检测芯片、
芯片实验室等。 按探针种类和制作方法分为：寡聚核苷酸点阵芯片
基因芯片使用流程 1. DNA阵列的构建和印制： 支持物预处理： ➢ 实性材料：硅芯片、玻璃片和瓷片，需进行预处理使其
表面衍生出羟基、氨基活性基团。 ➢ 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜，通常包被
氨基硅烷或多聚赖氨酸。 根据应用目的选择合适的探针：如寡核苷酸、cDNA片
段或特定的功能基因等，按统计方式设计成点阵列。构 建方式有：
(ONA)(原位合成芯片)，cDNA点阵芯片(CDA)。
项目 芯片密度 核酸长度 主要成本 随意性 扫描寻址
ONA和CDA的制作及应用
就位合成法制作ONA
微量点样法制作CDA
高密度
中等密度
<25mer
500～5000mer
遮闭网的投资大 局限于ONA
仪器投资 DNA、抗原抗体、受体药物等
较易有序测读，但要求分辨率高 测读软件较复杂，易做对比分析
表达图谱，新基因鉴定， 诊断。
Hysep(Sunnyv ale.CA)
500～2000nt的DNA样品打印
在0.6cm2(HyGnostics)～
放射性同
18cm2(Gene Discovery)的膜上，位素或荧
预制5mer寡核苷酸在玻璃上 光
打印或1.1cm2阵列(HyChip)
表达图谱，新基因鉴定， 诊断，多态性分析，大 规模测序，大样品测序。
的杂交温度。 突变检测：主要鉴别单碱基错配，需时较短(12~18h)，
但杂交条件要求高。探针质量影响很大，纯化探针信噪 比低，阳性信号较强。
芯片杂交炉(Hybridization oven) 生产商：Affymetrix。 全自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的
转动提供充分的混合。可同时处理64张芯片。
行性，可自动化、微型化、集约化和标准化。 缺点： ➢ 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。 ➢ 成本过高(宝生物2000~10000/片)；芯片标准化有待统一。 ➢ 如何提高芯片特异性，简化样品制备和标记操作程序、
增加信号检测灵敏度和消除芯片背景对结果的影响等都 是亟待解决的问题。
D
N
A 芯 片 原 理 图
incyte Pharmaceutica ls(Palo.Alto.C A)
喷墨式打印PCR片段和在片 合成
荧光和放 射性同位 素
表达图谱，多态性分析， 诊断。
Molecular Dynamics(Sun nyvale.CA)
笔式捞钱500～5000nt cDNA 于玻璃片上～10cm2
荧光
表达图谱，新基因鉴定。
目前，大多用ONA测定短DNA序列、对已知序列再测 序或查找单核苷酸多态性(SNP)。
2.基因表达水平检测： 用于基因表达分析具有快速、可自动化等优点。 ➢ RNA印迹法只适用于高丰度的mRNA。 ➢ RT-PCR可检测低丰度mRNA，但只限于单个基因，且
难以定量，有假阳性，需要亚克隆和再测序加以证实。 ➢ 基因表达系列分析(SAGE)是较好的cDNA测定方法，但
原理 利用核酸杂交原理检测未知分子的技术。具体是将一定
规模的核酸片段(cDNA、EST 或寡聚核苷酸等)作探针， 按设计的次序排列固定于特定的固相支持载体(纤维素、 硝酸纤维素、尼龙、硅片、金片及载玻片等) 表面，与 不同细胞、组织或器官来源的cDNA第一链杂交，用以 分析各种生物分子存在量。
优势及问题 优势：大规模、高通量，快速高效、高灵敏度，高度平
1991年，Steven Fordor等人将照相平板印刷、半导体、 激光共聚焦扫描、寡聚核苷酸合成、荧光标记和计算机 分析等技术结合起来在硅片上合成高密度的寡核苷酸点 阵，制成第一块芯片。
1994年，美国、俄罗斯研制出用于检测β地中海贫血病 基因突变的生物芯片，筛选出100多个β地中海贫血已知 的基因突变。
讲座三 生物芯片技术及其研究进展
基因芯片 蛋白芯片 组织芯片 糖芯片
基因芯片(Gene Chip)
基因芯片(Gene chip)技术：指通过微阵列(Microarray)技 术，将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成 方式，以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等 固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交 原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。
➢ 原位合成：将所需核酸片段就位合成于芯片上。
✓ 显微光蚀刻技术：支持物表面活性基团连接有光敏保护
基团(X)，受到保护。
✓ 产率较低。
Light directed oligonucleotide synthesis. A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.