生物信息学Ｃｈｉｎａ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｉｎｆｏｎｎａｔｉｃｓ专金仑与ｊａ生七

生物芯片技术研究进展

常胜合‘，２＊，舒海燕３，李滨‘，英加‘，李振声‘

（１．中科院遗传与发育生物学研究所，北京１００１０１；２．郑州大学物理工程学院离子束生物工程实验室，河南郑州４５００５２； ３．郑州大学生物工程系，河南郑州４５０００１）

摘要：生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。利用生物芯片技术可以从整个基因组的水平上对基因进行快速分析、筛选。本文主要概述了生物芯片技术的最新研究进展及在各个领域内的应用，并对生物芯片技术面临的挑战以及未来的发展方向作了讨论。关键词：生物芯片；基因组中图分类号：Ｑ８１文献标识码：Ａ文章编号：１６７２－　５５６５（２００５》一０１一００３０一０４

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｂｉ

ＣＨＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇ一Ｈｅ　１，２，ＳＨＵ　Ｈａｉ一，Ｌｌ　Ｚｈｅｎ一Ｓｈｅｎｇｒ（１．　ｌｎａｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ＤｅｕｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｔｅｄｕ滋ｇｙ　Ｌａｂ，Ｚｈｍｇｚｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｚｈｍｇｄｗｕ　４５００５２；了，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＺｈｅｒｎｇｚＪｗａ　Ｕｒｕｖｅｒｓ勿，Ｚｈｅｒｒｇｚｈｏｕ，４５０００１，ａｕｒａ）Ａｌｓｆｔ－ａｃｔ：　Ｂｉｏｃｈｉｐ　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　ｇｅｎｅｃｈｉｐ，　ｐｍｔｅｉｎｃｈｉｐ，　ｔｉｓｓｕｅｒｎｉｃｒｏａｒｒａｙＵｓｉｎｇ　ｂｉｏｃｈｉｐ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｗｅｃａｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍＲ－ＮＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ　ｇｅｎｏｍｅ．＇ｌｌｒｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｃｈｉｐ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ａｎｄ　ｔａｌｋ　ａｂｏｕｔ　ｃｈａｌｅｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｔｒｅｎｄｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　ｂｉｏｃｈｉｐ；　ｇｅｎｏｍｅ

生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号即可实现对生物样品的分析。目前常见的生物芯片主要有基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐ，

ＤＮＡｃｈｉｐ，　ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ），蛋白质芯片（ｐｒｏｔｅｎｃｈｉｐ）、组

织芯片（ｔｉｓｓｕｅ　ｎｒｉｃｒｏａｒｒａｙ）等。基因芯片也可以叫做ｒｅｖｅｒｓｅ　ｎｏｒｔｈｅｒｎ一ｄｏｔ　ｂｌｏｔｓ（Ｅｌｌｅｎ　Ｗｉｓｍａｎ　ａｎｄ　ＪｏｈｎＯｈｈｏｇｇｅ，２０００），目前主要有检测基因突变的基因芯片和检测基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片技术主要包括芯片微阵列制备、样品制备、杂交、信号的检测和分析等。蛋白质芯片主要是蛋白质如抗原或抗体在载体上的有序排列，依据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理进行杂交、检测和分析。从不同的组织内进行活体解剖后取出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内，这样的石蜡块集成体

便构成了组织芯片（Ｗａｎｇ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ，２００２）０

１生物芯片的应用

１．１检测基因的表达 目前检测基因表达的方法主要有Ｎｏｒｔｈｅｒｎ，　ＲＴ　－ＰＣＲ，ｎｉＲＮＡ差异显示、ｅＤＮＡ代表性差异分析等。这

些方法都只能对少数几个基因的表达进行分析。但生物体是一个复杂的网络，任何一个刺激都会牵动

网络的许多环节。只对少数几个基因的表达进行研

究显然是不够的。生物芯片技术恰好能够从整个基因组水平上对某一刺激或疾病进行检测。例如，Ｂｉｔ－

ｔｎｅｒ　Ｍ等（２０００）对８　１５０个基因进行检测，发现了皮

收稿日期：２００４－０６－１６；修回日期：２００４－１０－２９，作者简介：常胜合（１９７４一），男，河南省唐河县人，博士，主要研究方向：植物逆境胁迫研究，Ｔｅｌ：０３７１一７７６７７２８，Ｅ一ｍａ“二ｓｌｉｄ－ｎｇ＠　ｅｙｏｕ　．，

万方数据第１期常胜合，等：生肠芯片技术研究进展

肤黑素瘤的亚种。Ｚｈａｎｇ　Ｗ等（２００２）发现类胰岛素生长因子结合蛋白２（ＩＧＦＢＰ２）在神经胶质瘤和恶性胶质瘤的后期阶段表达量很大，且差异很大。Ｇｕ　Ｊ

等（２００１）对患有ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ　ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ　（ＡＳ　）、类风湿性

关节炎（ＲＡ）和正常人的外周血单核细胞（ＰＢＭＣ　）的基因表达进行分析后发现，患有ＡＳ的病人与患有

ＲＡ的病人的ＰＢＭＣ表达模式差异很大，且极不正常。Ｔａｎａｋａ　Ｆ等（２００２）用芯片分析后发现了在ＦＡＯ

和Ｃ２细胞系之间表达有差异的基因，并从扣除文库中用抑制扣除杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａ－ｔｉｏｎ）的方法分离到了一个ｃＤＮＡ克隆，该克隆在Ｃ２内的表达强于在ＦＡＯ内的表达。Ｎａｋｅｆ　Ａ等（２００２）

用一定浓度的ＸＫ４６９对结肠细胞ＨＣＴ一１１６处理

２４ｈ后，再与芯片杂交，结果发现在１　１５２个基因中，

有７１个基因的表达量变化超过２倍以上。

１．２研究生物体对逆境的反应 Ｒｏｎｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ等（２０００）用生物芯片对拟南芥在低氮（２５０ｕＭ）和高氮（５一ｌｏｍｍ）条件下基因表达的

差异做了分析后发现，表达差异的基因不仅包括以

前已经报道过的基因如硝酸还原酶（　ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃ－ｔａｓｅ）、硝态氮转运蛋白（ｎｉｔｒａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）等，还发现

了许多新的受低氮诱导表达的基因如钙离子反向运

输因子（ｃａｌｃｉｕｍ　ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）、蛋白激酶以及与代谢有

关的酶（如转酮酶、天冬酞胺合成酶、组胺酸脱梭酶

等）。Ｍｏｔｏａｋｉ　Ｓｅｋｉ等（２００１）发现，拟南芥受旱胁迫和

冷胁迫后，在１　３００个全长。ＤＮＡ中，有４４个受早胁迫诱导，１９个受冷胁迫的诱导，有１２个是控制胁迫

诱导转录因子ＤＲＥＢＩＡ／ＣＢＦ３的靶向诱导基因（ｔａｒ－ｇｅｔ　ｓｔｒｅｓｓ一ｉｎｄｕｃｅｄ一ｇｅｎｅｓ）。Ｓｈｉｎｊｉ　Ｋａｗａｓａｋｉ等（２００１）

发现，水稻（ｖａｒ　Ｐａｏｋｋａｌｉ）受１５０ｍＭＮａｃ１胁迫１５ｍｉｎ后，Ｐａｏｋｋａｌｉ的转录受到正调控，大约ｌｈ后，约有

１０％的基因受到显著的正调控或负调控，在对照株和试验株之间基因表达的差异可延续数小时，但差异越来越不明显，一周后基本无差异。Ｏｌｉｖｅｒ　Ｔｈｉｎｕｎ

等（２００１）发现拟南芥幼苗缺铁３ｄ后，参与糖酵解、

三梭酸循环、氧化戊糖磷酸途径的基因以及在根中参与无氧呼吸的酶的基因表达量增加，苗中参与葡

糖异生作用（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）、淀粉分解、韧皮部装载的基因也受到诱导表达。

１．３研究生物体对光线的反应 Ｌｉｇｅｎｇ　Ｍａ等（２００１）发现，拟南芥幼苗被远红光、

红光和蓝光分别照射后，表达相似的调节基因基本占到整个基因组的三分之一，其中五分之一的基因受到正调控，五分之二的基因受到负调控，共有２６个细胞途径参与了光调节。Ｙｕｋａｋｏ　Ｈｉｈａｒａ等（２００１）发现，当改变对单细胞蓝藻细菌Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ　ＰＣＣ

６８０３光合器官照射的光强时，共有１６０多个基因的

表达出现了差异，那些参与光呼吸和光化学反应的基因在强光照射１５ｍｉｎ后受到负调控，而与二氧化

碳固定和受到光抑制保护的基因则受到正调控，那些表达有利于细胞增殖的基因如参与复制、转录、翻

译的基因也受到诱导表达，不过反应较晚。ＲｏｂｅｒｔＳｃｈａｆｌｅｒ等（２００１）发现拟南芥在１８ｈ光照／／６ｈ黑暗处

理的条件下，在代表了７　８００个无重复基因的１１　５２１个ＥＳＴ片段中，有１１％的基因表达出现了差异，有

２％的基因表现出有规律的变化。 除了上述的几个方面外，生物芯片在细菌鉴定

（Ｊａｅ一Ｃｈａｎｇ　Ｃｈａｏ　ｅｔ　ａｌ，　２００１）、环境检测（Ｊａｃｋ　Ｓｍａｌ　ｅｔａｌ，２００１）、发现新基因（Ｙｕｅｍｅｉ　Ｄｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ，　２００１）等各

个领域也有着广阔的应用前景。

生物芯片技术的最新研究进展

１微珠芯片的发展 生物芯片技术目前比较显著的一个研究进展是２

２

微珠芯片的研制（Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ，　２０００）。其原理是先

建立ｔａｇ文库和ａｎｔｉ一ｔａｇ文库，在体外将不同的ｃＤ－ＮＡ克隆后，附着在不同的微珠上，微珠在系统内流

动，在流动的过程中与被标记上特定颜色的探针杂交，携带特定颜色的微珠被扫描下来，进而研究基因

的表达。２．２在微ｆ　ｍＲＮＡ的检测技术方面的进展

以前一般认为，生物芯片技术对ＲＮＡ的量有一定的要求，每次杂交一般需要５０一２００ｍｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ

或１一２ｍｇ　ｍＲＮＡ　（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ，２００１），要求有较

多的材料。但有时我们只能获得较少的材料，例如研究蝇或蠕虫的微小器官（Ｄａｖｉｄ　Ｊ．　Ｌｏｃｋｈａｒｔ＆Ｅｌｉｚａ－ｂｅｔｈ　Ａ．　Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，　２０００）。这对生物芯片技术提出了

更高的要求，而Ｈｅｔｚｂｅｒｇ等（２００１）用靶标签扩增（ｃＤＮＡ　ｔａｇ　ｔａｒｇｅｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）的方法进行分析，只需

０．　１　ｕｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ即可满足要求。其原理是提取ＲＮＡ后，反转录为ｃＤＮＡ，然后将ｃＤＮＡ剪切为２００一６００饰

长的片段，筛选ｃＤＮＡ３’端，用ＰＣＲ扩增的方法获得足够量的ｃＤＮＡ，再去进行芯片分析。用多轮线性扩增的方法同样可对来自５００一１　０００个细胞的ＲＮＡ

或者１一５０ｎｇ的ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ进行分析（Ｌｕｏ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ，

万方数据生肠信忽学第３卷

１９９９；　Ｄａｖｉｄ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ，　２００１）。Ｋａｒｓｔｅｎ　ＳＬ等（２００２）用

ＴＳＡ（肠ｒａｍｉｄｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）的方法也可以从少量组织内提取ＲＮＡ进行分析。

２．３检测结果处理技术的进展 如何消除芯片背景对于结果分析的影响，例如因各个操作环节的原因，芯片沾有污染物，芯片的最

后结果实际上是污染物和真实信号的综合体现，所

以当用芯片上的这些结果进行分析时，哪些点是可靠的，哪些点的表达确实有差异，不同实验室、不同

操作人员作出的结果如何进行统一化、标准化，对此

Ｊｉａｎｇ　Ｌ等（２００１）认为，尽管生物芯片的结果存在着人为因素影响，特别是那些表达量低、差异不明显的基因。但是这些误差可以通过传统的蛋白质分析技

术如酶谱、ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ、双向电泳、免疫组织化学等进行验证。他们从同一心脏组织内取样后用这几种技

术分析后都得到了相似或互补的结果。Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｒ．Ｈｅｓｓ（２００１）等采用ｓｍｏｏｔｈｅｄ　ｅｓｔｉｍａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ

ｒａｎｇｅ的方法研究后认为，在＋／一３ＸＩＱＲ曲线以外的点都是不可用的，不同实验室之间的结果比较可以

用一个或一组（多于７５个）持家基因的表达量作为标准。Ｊａｓｏｎ　Ｃｏｍａｎｄｅ：等（２００１）研制的芯片处理软件

可以辨别结果的真伪，并能够计算芯片上各基因表达的强度。现在已经有一部分类似的软件（Ａ．　Ｋｕｋ－ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ，　２０００；　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．　Ｃｕｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ，　２００１）。最近对生物芯片实验数据的分析处理的研讨会在Ｄｕｋｅ大学

举行（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｎｎａｔｉｃｓ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｃａｍｄａ）　（ＳｏｕｍｙａＲａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ　ｅｔ　ａｌ，　２００１），并对处理这类数据的一系

列方法作了评价。

２．４蛋白质芯片的研究 Ｈｅｎｇ　Ｚｈｕ等（２００１）克隆了５　８００个酵母的开放

阅读框，表达并纯化了相应的蛋白质，将这些蛋白质固定在芯片上，做成酵母的蛋白质组芯片，对芯片进行分析后发现了许多新的与钙调蛋白、磷脂互作的

蛋白。发现一个普通的蛋白结合域竟是许多钙调蛋白的结合位点。这是目前为止第一个生物的全蛋白

质组芯片。

３未来的发展趋势

生物芯片在近几年发展极为迅速，但它也面临着巨大的挑战，主要体现在以下几个方面。

（１）所需费用较高。目前生物芯片设备所需费

用仍旧较高，如Ａ咖ｌｅｔｒｉｘ的一套系统需要１３．５万美元（Ｓｈａｌｏｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ，　１９９６），对普通的实验室来说开支较大，这对于生物芯片技术的推广是一个很大的

障碍。 （２）自动化程度不高。目前生物芯片技术对操作人员仍要求较高，每个实验室都需要一个专门的技术人员去建立并操作。如何提高生物芯片实验的自动化程度，简化操作步骤，使其缩微化，将生物芯片的各个操作环节集中到一个或少数几个仪器里

边，就像目前的ＰＣＲ仪那样，使那些即使对生物芯片技术不甚熟悉的人也可以操作，这将是生物芯片技术未来的一个重要的发展方向。（３）目前，对于实验的许多结果还不能做出完美的解释。这将依赖于生物学的整体发展，这也促进了人们对生物学进行更深层次的研究。（４）对结果的扫描、去除背景、数据处理等，目前还不能作得很完美。但随着一大批硬件、软件的开发，相信这些问题都将会被克服。 生物芯片技术尽管存在着上面所说的巨大挑战，但生物芯片技术仍将是２１世纪极为重要的一项

生物技术。随着各国研究者的不断努力，它必将在

更大的范围得到应用。参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：［１１ Ａ．　Ｋｕｋｌｉｎ，　Ｓ．　Ｓｈａｍｓ＆Ｓ．　Ｓｈａｈ．　Ｈｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ［　Ｊ］　．　Ｇｅｎｅｔｉｃａ，　２０００，　（１０８）　：４１一４６．［２］ Ｂｉｔｔｎｅｒ　Ｍ，　Ｍｅｌｔｚｅｒ　Ｐ，　Ｃｈｅｎ　Ｙ，　ｅｔ　ａ］．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｔｓ－ ｎｅｏｕｓ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ场ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．　Ｎａｔｕｒｅ，２０００， （４０６）　：５３６一５４０．［３］ Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｓ，　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｍ．Ｂｒｉｄｇｈａｍ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（　ＭＰＳＳ　）。ｍｉｃｒｏｂｅａｄ　ａｒａｙｓ ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，（１８）：６３０一６３４．［４］ Ｄａｖｉｄ　Ｊ．　Ｃｕｔｌｅｒ，　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｅ．　Ｚｗｉｃｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｉｇｈ一ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ〔Ｊ］．Ｇｅｎｏｎｒｅ　Ｒｅｓｅｒｃｈ， ２００１，（１１）：１９１３一１９２５．［５］ Ｄａｖｉｄ　Ｊ．　Ｌｏｃｋｈａｒｔ　Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ　Ａ．　Ｗｉｎｚｅｌｅｒ．　Ｇｅｎｏｒｎｉｃｓ，　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ ＤＮＡ　ａｒｒａｙｓ［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，　１５（４０５）　：８２７一８３６．［６］ Ｆａｄｏｒ　Ｓ　Ｐ　Ａ，　Ｒｅａｄ　Ｊ　Ｌ，　Ｐｉｍｍｇ　Ｍ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．ｈｇｈｔ一ｄｉｒｅｃｔｅｄ，　ｓｐａｔｉａｌｙ　ａｄ－ ｄｒｅｓｓａｂｌｅ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，（２５１）：７６７一７７３．［７］ Ｇｏ　Ｊ，　Ｈｕａｎｇ　Ｆ，　Ｙｕ　Ｄ．　Ａｎａｌｙｓｉｓ‘ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｉｎ　ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ　ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ［Ｊ］． Ｚｈｏｎｇｈｕａ　Ｙｉ　Ｘｕｅ　Ｚａ　Ｚｈｉ，２００１，８１（１７）：１０３０一４．［８］ Ｈｅｎｇ　Ｚｈｕ，　Ｍｅｔｉｎ　Ｂｉｌｇｉｎ，　Ｒｈｏｎｄａ　Ｂａｎｇｈａｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｏｂａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｃｈｉｐｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００１，１４（２９３）：２１０１ 一２１０５．［９］ Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ　Ｍ，　Ｓｉｅｖｅｒｔｚｏｎ　Ｍ，　Ａｓｐｅｂｏｒｇ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ　ｓｍａｌ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｃＤＮＡ　ｔａｇ　ｔａｒｇｅｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏ－ ｔｏｃｏｌ［　Ｊ］　．＇Ｉｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｍｏｌ，　２００１，　２５　（５）　：５８５一９１．［１０］　Ｊａｃｋ　Ｓｍａｌｌ，　Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｒ．　Ｃａｌｌ，　Ｆｒｅｄ　Ｊ．　Ｂｒｏｃｋｍａｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｒｅｃｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ‘１６ｓ　ｒＲＮＡ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７（１０）：４７０８一４７１６． （下转第４１页）

万方数据