交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为：
网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
包埋条件 酶活性 强度
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙 、角叉菜胶、明 胶
网格型 微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用 ，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换 剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表 观Km值降低。
固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表 观Km值显著增加。
（六）酶的作用专一性
与自然酶基本相同。但大分子底物 难于接近酶分子，导致酶的专一性发生 改变。
二、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况 比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
• 固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限定 的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的 酶。（1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议）
• 固定化细胞（定义）：将具有一定生理功能的生物 细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方 法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一 门技术。
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。
缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法，与其它固定化方法相比：
•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改 变酶的高级结构，酶活回收率高。 •缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶 。
乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
2.葡萄糖异构酶
世界上生产规模 最大，应用最为成功 的一种固定化酶。
二、固定化酶在医学上的应用
1. 消血栓：
吸附法 共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
不变 可变 可变
1.酶传感器
固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： ①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活 力-上清液中未偶联酶活力)×100%
(四)半衰期
在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活 力下降为最初活力一半所经历的连续工作时 间，以t1/2表示。
是衡量稳定性的一项重要指标。
不同固定化方法的比较
carriers
Agar po1yacrvlamlde Gelatin carragheenan Glutaraldehyde
纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫 反应，无法长期使用。
酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。
用包埋法制备的酶固定化技术可克服
上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物
质能自由进出。
2. 人工肾：
原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成 氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶 和微胶囊活性炭组成人工肾。
三、在分析检测中的应用
②载体要求： a.固定化的载体应与酶结合较为牢固。 B.载体不能与底物、产物等发生化学反应。 C.载体必须有一定的机械强度，防止因机械搅拌而破
碎。 ③位阻应该较小：尽可能不妨碍酶与底物的接近。 ④成本低：酶固定化的成本要尽可能的低。
优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用 。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一 种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
吸附法 包埋法
微生物细胞 植物细胞 动物细胞
吸附力较弱 ，细胞易脱 落
实验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后 ，由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
而固定化后， 70℃，15分钟，有>80%活 性。
（三）酶的最适பைடு நூலகம்度
最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度 也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。
（五）酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电 性能变化。
42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
四 原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法） 。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角 叉菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生 质体破裂。
第二节 固定化酶和固定化细胞 的性质与表征
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 交联树脂
温和 聚合反应
不变
差
部分失活 高
海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
角叉菜胶包埋法： 滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP
Acr+ Bis+E (or cell) TEMED
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔 膜内 。
半透膜：直径几十微米到几百微米，厚 约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜 孔径的小分子底物和产物可以自由进出 ，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系统 。
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
固定化酶与固定化细胞
2020年4月24日星期五
本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理；
②细胞固定化的基本技术和原理； ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因
子的固定化方法和辅酶的再生体系。
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
（一）酶的活性 ：
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋 白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形；
②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
如：氨基酰化酶，
70℃，15分钟，酶失去活性。
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2. 固定化方法
1.固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式