酶与细胞的固定化 特点和利用
固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位 于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。
第一节 酶与细胞的固定化
一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一 种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
实验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到
42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法，与其它固定化方法相比： •优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变 酶的高级结构，酶活回收率高。 •缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法 共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
2. 固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学 方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
角叉菜胶包埋法： 滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP
Acr+ Bis+E (or cell) TEMED
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation）
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微
交联反应既能发生在分子间，也可发生 在分子内。 • 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
1.固定化酶(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化
反应的酶。
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
网格型 微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用， 使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、 叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
（三）原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。 常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉 菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生 质体破裂。
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
纤维素
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解 吸附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百
微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透
膜孔径的小分子底物和产物可以自由进
出，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。