菌种保藏方法 –液氮超低温保藏法
方法：将成熟期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一 密封。冷冻后治愈液氮中保藏。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：数十年。 优点：适用范围广，保存时间长。 缺点：设备特殊。 注意事项：注意液氮的存量；所用的保存管可耐受大的温差； 菌种复苏时需迅速解冻。
菌种保藏方法 –液体石蜡保存法
方法：将微生物接种至培养基斜面上或半固体高层培养基中，按 规定的温度和时间培养。加入灭菌、干燥的液体石蜡，置于4℃左 右的冰箱中保藏。 适用范围：适用于部分霉菌、酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果 较差。 保藏时间：1年以上。 优点：操作简单，不需要特殊设备。 缺点：保保存时必须直立放置, 所占位置较大, 不方便携带。 注意事项：严格控制液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度，一 般以高出1cm为宜，液体石蜡需保持干燥。
菌种保藏方法 –沙土管保藏法
方法：将微生物的新鲜培养物接种至灭菌的沙土管中，使菌体或 孢子依附在沙粒上混合均匀再干燥保藏。 适用范围：适用于部分霉菌、酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果 较差。产孢芽孢的细菌，产孢子的霉菌和放线菌，对营养细胞效 果 不佳。 保藏时间：1-10年。 优点：设备简单 。 缺点：操作较复杂，适用范围小。 注意事项：沙土管一旦接种好，应立即干燥，一般在12小时内抽 真空干燥。
• 低温、干燥、缺氧是菌种保藏的重要手段。
菌种保藏方法
• 传代保藏法 • 液体石蜡保存法 • 沙土管保藏法 • 冷冻保藏法 • 冷冻真空干燥保藏法 • 液氮超低温保藏法 • 麸皮保藏法 • 滤纸保藏法 • 半固体穿刺保藏法
菌种保藏方法 –传代保藏法
方法：将微生物接种至培养基斜面上，按规定的温度和时间培养， 待充分生长后，将斜面置于4℃左右的冰箱中保藏。 适用范围：细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等。 保藏时间：1-6个月。 优点：操作简单，不需要特殊设备。 缺点：保藏时间短，传代次数多，易发生变异和退化，易被污染。 注意事项：使用对数期或稳定期的微生物；需定期检查冰箱的温 度及菌种管是否包装完整；每次传代需要确认 微生物 特征及纯度； 铜绿假单胞菌不可直接置于冰箱 中保存。
菌种保藏方法 –冷冻干燥保藏法
方法：将微生物培养物 混合于有保护作用的介质内， 分装到无菌 的安瓿瓶中， 于低温冰箱中冷冻， 达到预定温度后对浓菌液进行 冷冻干燥处理，之后在真空状态下融封安瓿瓶中保藏。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：5-10年以上。 优点：保藏效果好，储存期长，存活率高，变异率低。 缺点：操作繁琐，需要一定的设备。 注意事项：真空干燥系统密封要好，真空度要高；预冻速度要快， 避免冰晶的形成。
国外菌种保藏机构
• 美国标准菌种收藏所(ATCC) • 法国巴斯德研究所菌物保藏中心 (CIP) • 英国国家典型培养物保藏中心 (NCTC) • 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(NCIMB) • 日本技术评价研究所生物资源中心 (NBRC)
菌种保藏的原理
• 根据微生物的生理、生化特性，在人工创造的条 件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞处 于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡， 以降低菌种的变异率。
1979年7月，在北京召开的全国第一届菌种保藏管理会议，正式成 立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），成立7个菌种保藏管理中 心： • 中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC (归口中国科学院) • 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC (归口中国农业科学院) • 中国工业微生物菌种保藏中心CICC (归口轻工业总会) • 中国医学微生物菌种保藏中心CMCC (归口卫生部) • 中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC (国家医药管理局) • 中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC (归口农业部) • 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC (归口中国林业科学院)
菌种保藏与管理
菌种保藏： • 菌种保藏的意义 • 菌种保藏机构 • 菌种保藏技术 菌种管理
菌种保藏的意义
选择合适的保藏方法，避免在保藏期间和传代过程 中死亡、变异及衰退，以保持菌种原有的各种生物 学特性，并防止杂菌污染。在适宜条件下， 菌种可 重新恢复原有的生物学活性，进行生长繁殖。
中国的菌种保藏机构
菌种保藏的注意事项
游龙，2005
菌种管理
• 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、 确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件（从 标准菌株到工作菌株），该程序包括：标准菌种的申购记 录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转 种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认， 并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、 传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置 和条件；其他需要的程序。
菌种管理
• 药品生产质量管理规范（2010年修订）
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应 当至少符合以下要求： （六）应当有检验所需的各种检定菌，并建立检定菌保存、 传代、使用、销毁的操作规程和相应记录； （七）检定菌应当有适当的标识，内容至少包括菌种名称、 编号、代次、传代日期、传代操作人； （八）检定菌应当按照规定的条件贮存，贮存的方式和时 间不应当对检定菌的生长特性有不利影响。
菌种管理
采购 保存 确认 传代 使用 销毁
菌种管理
采购 保存 确认 传代 使用 销毁
菌种保藏方法 –冷冻保藏法
方法：将成熟期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一定体 积的无菌甘油， 使甘油的最终体积分数为10%~20%， 密封。可以 根据实验室的条件将菌种置于- 70 ℃冰箱， 或者- 20 ℃冰箱中保存， 温度越低保存时间越长。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：1-10年。 优点：适用范围广，保存时间长。 缺点：需要一定的设备。 注意事项：选取最合适的保护剂； 注意要“ 慢冻快化”： 冷冻时降 温速率保持1 ℃/min。