菌种的管理和保藏
定期检查
菌种的鉴定与复壮
菌种的复壮 采用分离纯化的方法。
- 形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一 系列试验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致。
菌种的鉴定
微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性有关。 微生物鉴定需通过已建立的标准微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配 来完成。否则将得不到鉴定的结果. 明确鉴定系统局限性和需要的鉴定水平(属、种、型)。
菌株
枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
培养基
培养温度(℃)
胰酪大豆胨琼脂
30～35
或胰酪大豆胨肉汤。
沙氏葡萄糖琼脂或沙 20～25 氏
沙氏葡萄糖琼脂或马
铃薯葡萄糖琼 脂葡萄糖肉汤
20～25
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
菌液制备用稀释液—2015修定内容
广泛
5～10年以上 复杂、需要专门设备和方法，有效
干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无营养
产孢微生物
பைடு நூலகம்
1～10年
较简便，需制备沙土管，有效
液体石蜡保藏法
低温、缺氧
广泛
1年以上
简便
琼脂斜面低温保藏法
低温 4℃
广泛
短时间
简便
液体冷 冻保藏 法
液体培养基 一定比例甘油
瓷珠冷冻保藏法
低温 低温、缺氧 低温
广泛 广泛 广泛
↓ 斜面培养基 划线传代（4代） → 使用→ 分装冷冻保存
↓ 斜面培养基 划线传代（5代） → 使用→ 分装冷冻保存
。
菌液的制备和使用
斜面培养物1 ～ 3环 ↓
适宜液体培养基5～10ml，培养18～24h 取适 当量，用灭菌生理盐水稀释后比浊（或预实验）
↓ 按比浊结果或预实验将菌液稀释到相应倍数
↓ 平板计数(取上述稀释液1ml加入平皿中加入
菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁 殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作 工作菌株。
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用 。 稳定的黑曲孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
菌种的鉴定与复壮
菌种的衰退 由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 控制菌种的衰退方法 - 控制传代次数 降低突变几率，采用良好的传代保藏方法。 - 创造适宜的培养条件： - 用不同类型的细胞进行传代 - 采用有效的保藏方法
协调案 ATCC NCIMB
NBRC CIP
美国标准菌种收藏中心 英国食品工业与海洋菌种保藏中心
日本技术评价研究所生物资源中心 法国巴斯德研究所菌种保藏中心
菌种保藏的中心任务
- 广泛收集。 - 选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学特性。
常用菌种的保藏
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢 强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。
半年以上 数十年以上
1年以上
简便 简便 简便
菌种
金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
琼脂斜面低温保藏法
培养基
保存温度
营养琼脂斜面培养 基
疱肉培养基 改良马丁琼脂斜面
培养基
4℃
室温 4℃
传接时间 约1个月
约3个月
液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
菌种的管理和保藏
2020年5月17日星期日
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术 科学保藏和管理关系到检验结果的正确性.
菌种的—2015版指导原则
原则： 应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌 株所有相关特性等效的商业派生菌株。
使用菌种来源
菌种编号 2015版 CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）真菌 CMCC（B）细菌
菌种的保藏
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法： ⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落
⑵确定保藏的合适菌体形态 ⑶选择最适宜的方法保藏 ⑷定期检查
菌种的保藏
方法 液氮超低温保藏法
主要原理 超低温
适用的微生物 广泛
保藏时间 数十年
特点 复杂、需要专门设备，有效
冷冻真空干燥保藏法
干燥、缺氧、低温
分离技术
将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。
方法
平板划线 - 分段划线、连续划线 涂布分离法 倾注分离法等
培养
接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜 微生物生长的
环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。 需气菌培养法: 厌氧培养法
嗜温性微生物：15℃～45℃。
嗜热性微生物：45℃以上。
嗜冷性微生物：15℃以下。
培养后微生物的生长判断
固体培养基 有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。 液体培养基 浑浊、菌膜、沉淀等。
菌种的传代和使用
冻干菌种（0代） ↓
增菌培养 苏醒（1代） ↓
增菌培养 复壮（2代） → 分装冷冻保存 ↓
斜面培养基 划线传代（3代） → 使用→ 分装冷冻保存
规定培养基、培养、点计菌落数 ↓
实验、阳性对照
平板计数也可和试验同时进行
菌液制备用培养基—2015修订内容
修订前 营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；
修订后 胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤培养基；
改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基。
沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤培养基； 马铃薯葡萄糖琼脂 。
菌液制备用培养基—2015修订内容
常用菌种的保藏—2015指导原则
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌 种为第0代）。 采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 冷冻保藏：在低温下保藏，一般在低于-30℃或-70℃，是有效的长期储藏方法。 冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法法。 冷藏：在2～8℃保藏，是短期储藏方法。
保存条件 -80℃可保存数年.
菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
接种： 斜面培养基 半固体培养基 液体培养基 平板培养基
