缓冲间
工作流向
理想的PCR实验室分区设计模式
标本处理与核酸提取的质量控制
核酸提取试剂的选择 核酸扩增试剂的选择 试剂的分装保存 试剂的配置 对照的设立 核酸扩增仪器 扩增参数的设定

扩增产物的检测与分析 荧光定量 普通凝胶电泳 毛细管电泳
污染的控制和预防
常见污染的来源 控制污染的措施 消除污染的措施

全自动核酸提取仪
全自动核酸提取仪
基于核酸的分子诊断技术
荧光定量PCR检测
DNA
病 毒 颗 粒 裂解 加 样 RNA
FQ-PCR
荧光信号检测
RT-FQ PCR
核酸提取
荧光PCR检测系统
病毒荧光定量PCR反应
反应体系配置 内容
DEPC H2O Master MIX RT-MIX 引物 探针 对照设置： 阴性对照：灭菌双蒸水代替标本 阳性对照：提取好的阳性核酸标本
生物安全的概念

实验室生物安全
避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室 外扩散并导致危害的综合措施。

生物安全三个方面：
一指人类的健康安全；二指人类赖以生存的农业生 物安全；三指与人类生存有关环境生物安全。
微生物实验室生物安全

三项技术措施

样品隔离技术（机械、气幕)：防止传染因子进 入环境接触人体

定向气流技术（负压系统)：防止传染因子扩散 消毒灭菌技术（物理、化学)：灭活传染因子
实验室可以分为

基础实验室 —— 一级生物安全水平 基础实验室 —— 二级生物安全水平 防护实验室 —— 三级生物安全水平 最高防护实验室 —— 四级生物安全水平 根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计


电机 转速 最低转速 最高转速 转头 消毒方式 标准配件系统 噪音
高速（冷冻）离心机-使用方法

离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器 处于水平位置以免离心时造成机器震动。 打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先平衡好的 样品放置于转头样品架上，关闭机盖。


按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速 度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆 输入的各项信息。 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，用柔 软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室 温平衡后方可盖上机盖。
反应条件设置 1份样品的量
2.875ul 6.25ul 0.125ul 0.25ul
程序 循环数 温度 反应时间 1 2 3 1 1 45 50 95 95 30min 15min 15sec
60
1min
0.25ul
典型荧光定量PCR结果
阳性标本扩增曲线
阴性标本扩增曲线
二、质量控制要点
PCR实验技术的质量控制要点
核酸检测技术及质量控制
常州市疾病预防控制中心
王凤鸣
目
录
一、PCR实验技术操作要点 二、质量控制要点
三、实验室生物安全管理
一、PCR实验技术操作要点
常用仪器设备
加样器
PCR实验室应备有4套 连续可调加样器，分 别用于试剂准备、样
本处理、扩增和产物
检测四个试验区。
加样器的类型
单道连续可调式移液器

高速（冷冻）离心机-使用方法

机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹
配，并要求有良好的接地线。

开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。 离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危 险物品。 挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管， 并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。

三、实验室生物安全管理
为什么关注实验室生物安全？
三起SARS疫情后期的实验室感染事件
2003年9月8日：新加坡国立大学实验室，在P3实验室
同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究，一位27岁华人研 究员感染；
2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，一
名47岁的中校研究员，在P3实验室内清理SARS实验后的废 弃物时，未戴手套，因而感染；


严格实行分区操作
试剂储存和准备区
标本处理和核酸制备区
核酸扩增区 扩增产物分析区

实验人员的操作技能
PCR实验室设计的一般原则



各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作
产物分析区 扩增区 空气流向 空气流向 专用走廊
“十六字口诀”
标本制备区 空气流向
试剂准备区 空气流向
缓冲间
缓冲间
2004年4月22日：中国CDC病毒所，跨室开展SARS病毒
研究，并引发三代、9例 病例、1例死亡；另有两例 “隐 性”感染者。
引起实验室生物污染的原因很多很多
人员生物安全概念薄弱和技术操作不当；
生物安全柜和高压灭菌容器的不正常使用或使用
不当； 样品传递、接受和使用、装有冻干感染性物质安 瓿的打开； 匀浆器、组织研磨器、摇床、搅拌器和超声处理 器的使用； 离心机内装有潜在感染性物质的离心管发生破裂

吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体溅到移
液器头上；打出液体后拇指不应松开按钮，将 吸液嘴压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。

在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应
注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。

连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头
有液体时不可平放或倒置。
（一）高速（冷冻）离心机

分子生物学实验室的质量控制涉及到 整个基因检测扩增的所有阶段，确保检 测结果的准确性和可靠性，严禁各类交 叉污染事故的发生。
PCR实验技术的质量控制要点
PCR实验的过程主要包括：

标本处理与核酸提取 扩增试剂的准备 核酸扩增与产物分析 测定后的结果报告
PCR实验技术的质量控制要点

高质量无污染无降解的核酸制备
多通道连续可调式移液器
单道连续移液器
单道移液管配合使用的移液器
加样器的使用
加样器的校准
校准方式 计量局 厂家 自较 时间 视使用频率定（6个月-1年）

加样器-注意事项

根据所需取液量选择相应的移液器及吸头，基因扩增实 验要求使用带滤芯的吸头，防止交叉污染。
加样器-注意事项

高速（冷冻）离心机-使用方法

易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能 离心。 在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放 射性的物质或病原微生物。



离心机运行时不可人为地打开盖子。
如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则 应立即停止使用。 使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力 并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。