核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。
本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。
1. NAT在血液筛检中的必要性酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。
这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。
所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。
血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。
EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。
NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。
其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。
NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。
初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。
如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。
尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。
因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。
2. NAT检测的技术方法1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。
随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。
这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。
2.1 PCR扩增方法PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。
通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。
目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性。
若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。
由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。
虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。
而临床诊断和血液筛检是2个不同的应用领域, 血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。
迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV检测系统,FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一: 必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率>95%。
相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。
相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。
2.2 转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acidｓsequence based amplification, NASBA)。
TMA是一种利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录, 逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。
NASBA 的原理与TMA相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。
这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。
2.3 其它NAT技术包括支链DNA检测技术(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、连接酶链技术(ligase chain reaction, LCR)和链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)等。
这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。
如bDNA技术，在1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。
bDNA技术对待测DNA无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。
但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。
3. NAT在国内外血液筛检中的应用3.1 开展NAT检测的国家及所用的技术NAT是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检[12]，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV NAT筛检的国家[13],新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检; 德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检; 美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。
开展NAT检测的国家及其所采用的技术见表1：表1. 开展NAT检测的国家及所用技术汇总各国采用的技术各不相同（参见表1）。
日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的Ampli NATＴＭNPX系统（为荧光PCR技术，可同时联合检测HBV,HCV和HIV），目前正在考虑使用Chiron公司的TMA技术; 美国ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术;美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏COBAS Ampli Screen; 荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBAS Ampli Screen扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBAS Ampli Screen 扩增体系结合起来的方法, 随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。
各血站根据自身特色, 正在对各种不同的技术组合进行评估, 目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。
3.2 国外献血员中NAT检测结果从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，具体检测结果见表2。
表2 国外献血员中NAT检测结果汇总3.3我国核酸筛查技术应用研究情况3.3.1 我国核酸筛查技术应用我国有关NAT血液筛检研究的报道还比较少见。
比较规范的血液筛检研究更少，有的单位利用国产PCR试剂加电泳检测的方法进行检测，其实验室交叉污染的问题很难控制。
有关我国献血者及原料浆中NAT检测工作的情况总结于表3和表4。
表3 国内血液中心开展NA T检测研究的情况单位试剂检测方式NAT阳性文献深圳保安区中心血站美国BiotronicsTech HBV,HCVAmpliSensor试剂盒20人份混合15000rpm离心浓缩，半自动荧光定量PCR检测HCV NAT+: 1/8805(ALT 390U/L)；HBV NAT+: 抗-HBc阳性中：1/946；单项抗-HBc阳性中：5/495(1％)文献24厦门血液中心自行设计引物，HCV 50人份混合，NucliSensExtractor提取核酸，NASBA技术，混扩增，ECL 检测HCV NAT+: 2/10000,即1／5000文献25江苏省血液中心华美HCV RNA试剂盒单人份，PCR,电泳HCV NAT+: 2/750，即1／375文献26上海血液中心美国ChironProcleixHIV-1/HCV 8人份或24 人份混合；TMA技术；化学发光检测HCV NAT+: 0／103539;HIV NAT+: 0／103539;文献7北京血液中心匹基HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCRHCV NAT+: 0/34373;HIV NAT+: 0/34373文献27多单位参加的国际合作美国ChironProcleix HIV/HCV16 人份混合；无菌采血管EDTA抗凝，TEAN自动混样；TMA技术；化学发光检测HCV NAT+：2 /80259(其中1个ALT 254IU/ml)HIV NAT +：0/80259文献28深圳血液中心RocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV 24人份混合，STAR2000自动混样;Roche MPLC自动提取核酸；Roche COBASAmplicor 扩增和检测HCV NAT+: 0/16512;HIV NAT+: 0/16512;HBV NAT+: 8/16512,即1/2064文献29及个人交流(深圳血液中心,王良华，2005年５月)沈阳血液中心匹基HCV 荧光PCR核酸检测试剂24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCRHCV NAT+: 0/8.3万个人交流(沈阳血液中心，李剑平博士，2005年6月)中山中心血站及芜湖中心血站厦门长城，无锡三星，上海正业 HCVPCR单人份，PCR,电泳HCV NAT+:77/28098(1/365)文献30 表4 国内原料浆开展NAT检测研究情况3.3.2 我国核酸筛查技术应用工作小结：1）NAT检出率：有限的研究数据表明，我国献血者血液NAT检出率HCV NAT+ 检出率结果差异很大，从1/365（国产试剂,电泳）～1/4.0万～0/10.4不等；HIV NAT+检出率 < 0/10.4万；HBV NAT+为 1/946（anti-HBc+ 献血者中) ～1/2088。