常用的是DMSO。
保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在 培养基里，或者是溶解在有糖或 无糖的水中。
保护剂应当缓慢加入。 使用复合冰冻保护剂比单独使用
更为有效。
降温冰冻操作
快速冷冻法 慢速冷冻法 预冷冻法 干燥冷冻法 包埋脱水法 玻璃化法
1、快速冷冻法
指将植物材料从0℃或者其他预处理温度直接 投入液氮中保存的方法，降温速度1000℃/min。
材料的预处理
❖材料的预培养
❖材料的低 温预处理
冰冻保护剂预处理
常用的冷冻防护剂：多为小分 子中性物质，在溶液中易结合 水分子发生水合作用，使溶液 粘性增加，弱化水的结晶过程， 达到保护的目的。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
◆分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱
抑制外植体生长的离体保存方 法
降低温度：抑制生长最常见的方 法。
降低环境中的氧含量：低气压处 理、低氧分压处理
使用生长延缓剂：多效唑、矮壮 素
其他方法：
种子保存
• 优点：占用空间少，保存期较长，易干 燥，易包装和运输。
• 缺点：不适用于无性繁殖的植物种类， 随着时间的延长，种子的生活力逐渐下 降，同时易受到病虫害的侵袭。
物的细胞或组织经过防冻处 理, 在液氮超低温- 196℃ 下保存的方法。
超低温冰箱
离体植物材料的超低温冰冻保存技术
植物材料的选取 材料的预处理 冰冻保护剂预处理 降温冷冻操作 化冻操作 化冻材料的活力检测
材料的选择
常用于离体超低温保存的常用植 物材料
愈伤组织、悬浮细胞、原生质体 花粉和花粉胚 茎尖、胚、幼龄植株
2、慢速冷冻法
将处于0℃或其他预处理温度的材料以1— 2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃， 稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连 续降温至-196℃的方法。
c、预冷冻法
指将植物保存材料放入液氮前，需经过短 暂时间的低温锻炼的方法。
d、干燥冷冻法
将材料置于27—29℃烘箱内降低植物含水 量，再投入液氮中保存的方法。
（优选）超低温冷冻保存种质
种质保存
• 是指利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有 的遗传物质保持其完整性，有高的 活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去。
按保存类型分类
按保存类型分类可分为两种类型
非原生境保存
原生境保存
亚马逊热带雨林
常用的种质保存方法
种子保存 种植保存 离体保存 超低温冷冻保存
e包埋冻存法
(
f玻璃化法
玻璃化冻存：采用添加高浓度抗 冻剂, 使细胞内水分固化形成玻 璃态的超低温贮存方法 。
特点 设备简单 操作方便 冻存效果好
化冻操作
a、快速解冻法 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃
温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度 为500—750℃/min。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻， 再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
种植保存
自然保护区，植物园，森林公园 缺点：占地多，需要大量的人力物力，
费用高，易受到自然灾害的影响
离体保存
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害 的影响，不受季节限制。短时间可实现大量 植物的增殖，无病毒。
缺点：连续不断的继代培养可能会引起染色 体和基因型的变异。
种质资源超低温保存是将植
化冻材料的活力检测
• 检验化冻后材料的生活力和存活率的最 根本方法是再培养。
• FDA、TTC等染色的方法进行快速检测， 只能作为生活力的预测指标
超低温保存技术的发展
1973年科学家首次成功地超低温保存 了 胡萝卜悬浮细胞。
1993年，英国国家种质库采用超低温保存 离体的苹果种质进行再培养成功。
超低温保存种质技术的应用前景
• 悬浮细胞和愈伤组织的保存 • 生长点冷冻保存 • 胚状体（体细胞胚、花粉胚）冷冻保存 • 原生质体冷冻保存
小结
生物细胞的低温冻存是防止生物种质灭绝的 重要途径
低温冻存技术的应用取决于冻存技术和在培 养技术的成熟程度
根据细胞类型选择冻存和解冻方法是再培养 成功的前提