➢ Genotypic (DNA) based systems (ABI MicroSeq)
➢ Cost ~$30.00 per sample for consumables ➢ Large environmental libraries, small clinical libraries ➢ Requires proprietary PCR reagents ➢ Extract to identification= 5 to 7 hours ➢ Difficult to use
GC-FAME 的优点
+ 色谱分析技术成熟，准确性高 + 重现性很高 + 自动化程度高，操作简便 + MIDI对所有菌属采用相同的标准程序 + 消耗品成本低 + 系统设备耐用，易维护 + No GC experience necessary
Sample Preparation
Standard Extraction Procedure
具有代表性的鉴定性特征峰
杆状菌 16:1w7c Alcohol; Iso 17:1 w 10c
黄质菌属
15:0 Iso 3OH
Weeksella
17:0 Iso 3OH
Cytophaga
Methylobacterium 18:1 w7c> 65%
棒状杆菌
TBSA
Microaerophils >70% 18:1 w 9c
40 A
fatty acids
Fatty Acid Naming
饱和的 不饱和的
环丙烷
16:0 16:1 w7c
17:0 环丙烷
O OH
O OH
O OH
Fatty Acid Naming
支链
带有羟基的 3OH
17:0 Anteiso 10:0 3OH
O OH
OH O OH
• Gram (-) bacteria 的脂多糖
PLFA分析的应用
研究因素
研究对象
有机物种类 有机物含量
水分条件 酸碱度 温度 施肥 农药 灌溉 污染
土壤 地表水 植物体内
微生物群落
细菌 霉菌 酵母 放线菌
研究目的
多态性分布 群落结构变化 微生物量变化
MIDI-PLFA联用应用技术
MIDI系统分析磷脂脂肪酸（PLFA）成分 原理：通过色谱等方法得到细菌样品脂肪酸谱图
格兰氏阴性 Straight chain Unsaturated 羟基 * Cyclopropane Iso/Anteiso
格兰氏阳性 Straight chain Unsaturated Iso/Anteiso *
生态龛位效应
Environmental
Clinical
Burkholderia cepacia 假单胞
，通过对比或者软件分析得到相关结论。
应用：分析环境影响因素如酸碱度、有机物含量 、水份和温度等和环境来源微生物多样性变化 的因果关系。
MIDI系统是目前唯一能做此类研究的产品，是鉴定环 境微生物分布最可靠的研究工具
细菌特征性标志物
标志物
DNA
单体
核苷
种类
4
应用
测序
Protein 碳水化合物
PLFA
Fatty acid profiles of same species are different based on ecological niche (Clinical vs. Environmental). MIDI has both Clinical and Environmental libraries.
Biomarker的种类
Chemical marker
脂肪酸、类脂、磷 脂、多糖和醌类
所有细 菌共有
细菌分 类鉴定
分枝菌酸
分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状 杆菌属和红球菌属等的分类鉴定
DPA
鉴别芽孢与繁殖体
蛋白质和核酸
细菌和病 毒共有
DPA: 2，6-吡啶二羧酸
病毒和细 菌的鉴定
Microbial Identification Systems
➢ Biochemical-based systems (Biolog)
➢ Cost ~$10.00 per sample for consumables ➢ Large clinical libraries, small environmental libraries (Biolog is reversed) ➢ Not good for Bacillus species ➢ Requires proprietary test cards, gram stains & offline tests ➢ Extract to identification= 2 to 24 hours
400种
> $10/样本，鉴定卡、试剂、 孵化器等耗材贵，一次性使 用
活菌
2-18小时
比浊器，VITEK系统的读取 设备，通用性差，色度分析 不如气相色谱分析结果好
< 50 种菌/天
需要革兰式染色
生化试剂不稳定，需要冷藏
生化试剂存在过期问题
Plasmids and Mutations
Burkholderia cepacia
Sherlock GC-FAME Libraries
Standard Extraction Procedure
➢ Aerobic Bacteria Libraries
➢ Clinical = 590 species ➢ Environmental = 900 species
➢ Anaerobic Bacteria Library
➢ Gas chromatography + fatty acid analysis (MIDI)
➢ Cost under $2.00 per sample for consumables ➢ Large environmental and clinical libraries ➢ Good with Bacillus species- 42 Bacillus species in libraries ➢ Requires no proprietary test cards, no gram stain & no offline tests ➢ Extract to identification= 9 to 20 minutes
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➢ Saponification
➢ Kills bacteria, forms sodium salts of the fatty acids
➢ Methylation
➢ Formation of fatty acid methyl esters (FAMEs)
➢ Extraction
➢ Extraction of FAMEs into organic layer
➢ 925 species
➢ Yeast Libraries
➢ 215 species
➢ Mycobacteria Library
➢ 31 species, including M. tuberculosis ➢ Not as sensitive as MIDI’s Sherlock
Mycobacteria Identification System
➢ Base Wash
➢ Clean up FAMEs, prepare for Agilent GC
Sherlock Microbial Identification
Standard Extraction Procedure
Culture
Saponification & Methylation
Extraction
2-D Plot
25 ED2
40 ED2
12 ED2 Same Strain
MIDI系统对不同土壤样品中微生物 群落结构的聚类分析结果
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北京华新安科科技有限公司
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© 2004 MIDI, Inc.
MIDI Sherlock全自动微生物脂肪 酸分析技术
微生物鉴定系统
• 安捷伦 6850/7890 GC • 安捷伦 ChemStation • MIDI’s Sherlock 模式识别软件 • MIDI’s 微生物数据库
没有时间限制
真菌库较强
1800多种 > $10/样本，鉴定卡、试剂、 孵化器等耗材贵，一次性使 用 活菌 16-24小时 手动系统菌库小，分析速度 慢，人为判断误差大；自动 系统价格昂贵 < 50 种菌/天 需要革兰式染色
生化试剂不稳定，需要冷藏 生化试剂存在过期问题
强项是药敏生化鉴定，菌库 小，少量的临床常见菌
PLFA分析的原理
脂肪酸(Fatty acid, FA)是活体微生物细胞膜的重要组分， 不同类群的微生物能通过不同的生化途径合成不同的脂 肪酸。脂肪酸作为生物标记物表征微生物量和微生物群 落结构等变化，因此通过测定脂肪酸成份就可以推出微 生物的信息。 主要有以下应用：
1. 土壤微生物分析 2. 地表水微生物分析 3. 植物宿主微生物多态性分析