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彗星实验步骤Comet assay

水稻植株彗星实验步骤
通过将Singh和Gichner等人建立的碱性彗星实验方案应用于水稻(Oryza sativa L.)来确定原发性DNA损伤。

所有的实验步骤都是在冰床上避光进行的。

1、对于每一盆水稻,取鲜叶0.1 g,用刀片切碎,加入2个100 μL装有三羟甲基氨基甲烷盐酸提取缓冲液(Tris-HCl提取液,0.1 M,pH=7.5,4℃保存)的离心管中;
2、每个离心管中取75 μL含细胞核样本添加到150 μL低熔点琼脂糖凝胶(LMPA,1%)中,混合;
3、取75 μL上述混合物,沉积在用正常熔点琼脂糖凝胶(NMPA,1%)制备的载玻片上,然后盖上盖玻片;
4、重复步骤3,每个样品制备3张载玻片,4℃保存15min;
5、在载玻片上添加一层LMPA以保护含有核的凝胶层;
6、将载玻片置于含有强碱性缓冲液(0.3 M NAOH和1 M EDTA,pH>13)的电泳槽中浸泡15 min,诱导DNA的展开和变性;
7、电泳,电压为25 V,电流为30 mA,持续5 min,将DNA片段从未受损的DNA链中分离出来,温度4℃,避光;
8、观察载玻片,每张载玻片分析30个核,利用连接到图像分析系统的摄像机对彗星进行了检测,并利用图像软件分析;
9、彗星尾部端点强度(TI)与DNA损伤水平呈线性关系。

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