大、成本高。
3 序列驱动的筛选 序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根据已 知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或
海洋微生物的研究进展
2014年4月29日
主要内容
一、海洋微生物的概述 二、未培养微生物的研究 三、海洋微生物培养的新方法 四、前景展望
概述
人类生存在一个被海洋覆盖的星球，海洋占地球表面 的70%以上，海洋中的微生物包括细菌、真菌、放线菌及 病毒等，提供了地球近一半的初级生产力，影响气候变化
，参与物质和能量循环等。
1、海洋微生物难培养的原因
另外，在饥饿状态下大多数微生物基因表达所涉及的 cAMP、与大多数革兰氏阴性菌的密度感应系统(quorum sensing)密切相关的酰基高丝氨酸内酯(HSLs)分子等都可能
是细胞之间沟通的信号分子。实验室对海洋微生物的纯培养
破坏了微生物之间的这种共生状态，微生物之间的信息交流 被阻断，生长必需的信号分子和生长因子缺乏，如许多海洋 细菌离不开藻类分泌的生长因子和维生素，所以表现为不可 培养。
，提供了一种探知微生物多样性结构和功能基因组的免培 方法，是一条寻找新基因及其产物的新途径。
宏基因组技术在开发未 培养微生物中的应用
1998年，ARIDA Pharmaceuticals公司的科学家Handelsman等首次
提出宏基因组(the genomes of the total micro biota found in
nature)的概念。宏基因组是指某一特定的环境中全部微生物（可培 养的和未培养）基因的总和。 宏基因组学( metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体 基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生 物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境 之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法，也称为微生物环境 基因组学、元基因的克隆载体有:
质粒载体(如pUC18和pUC19)，插入片段一 般小于10 kb； Cosmid(黏粒载体，如pWE15)，插入片段 30～45kb；
BAC(细菌人工染色体，如pBeloBAC11)，
插入虑以下因素 : 所提DNA的质量及研究目的，包括插入目的片段的大小、 所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。
微生物可能有抑制作用，甚至会出现底物加速死亡
(Substrate accelerateddeath)现象。
1、海洋微生物难培养的原因
同时，实验室培养无法完全模拟海洋环境，而生存环 境的巨大改变往往导致微生物不可培养。 (1) 在海洋中，微生物处于开放、流通的大环境，但在实验
室培养时，微生物只能在恒温、恒湿的条件下生长。
取使生长缓慢的微生物得不到充足的营养而生长受到限制。
在培养基平板上，一个菌落中细胞的数目至少为105个才能用 肉眼观察到，而那些生长速度较慢、其生长达不到高密度的 细菌种类，在培养基上用肉眼是看不到菌落的，从而导致这 些微生物的生长不被发觉，表现为“不可培养”。
1、海洋微生物难培养的原因
1.5 活的非可培养（VBNC）状态细菌的存在 细菌的VBNC状态，是指某些细菌处于不良环境条件下
特性
与陆地相比，海洋环境以高盐、高压、低温和稀营养为
特征。海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，因而有
其独具的特性。
1.嗜盐性
2.嗜压性 3.嗜冷性
特性
4.低营养性
5.趋化性与附着生长
6.多形性 7.发光性
研究进展
海洋微生物包括可培养微生物和未可培养微生物, 对于 可培养微生物的研究在很早就已经开展。然而海洋微生物中
研究目标应选择不同的宿主菌株。鉴于7O% 的抗生素来源于放线菌的事
实，若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想 ；而筛选新的酶所谓转化是指通过适当的方法使宿主细胞处 于感受态，从而摄取重组DNA的水平方向的基因转移过程。 其方法有CaC12法和电穿孔法。 CaC12法即用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为能摄取外源DNA 的感 受状态，该方法自建立以来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒 的转化，但该方法转化效率不高。 电穿孔法是用高压脉冲电流击破宿主细胞膜或击成小孔，从而使 外源DNA由小孔进入细胞，转化效率较高。
生物基因组，通过基因组学、蛋白质组学等手段来了解未
培养微生物的代谢途径、基因表达的调控机制等信息。
基于16S rDNA基因分析的方法在研究环境中的分类单 元和物种时起了很大的作用。但所能提供的信息量也是很 有限的。近年来发展起来的宏基因组学，利用分子生物学
的研究方法绕过纯培养技术来研究微生物的多样性及功能
基平板上却仅有少数的细菌（0.01-0.1%）能形成可见的
菌落。大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因可能是多 方面的。
1、海洋微生物难培养的原因
1.1 实验室的纯培养破坏了微生物细胞之间的交流 许多海洋微生物与其他海洋生物/微生物处于共生状态，
或其生长受周围其他海洋生物/微生物代谢产物以及一些其
它生长因子的影响，离开原生态环境则难以生长。 例如：铁是所有微生物的一种必需元素，而实际上海水中的 铁浓度非常低(＜0.4μM )，并且只有极少数海洋细菌能够 产生从环境中获取铁的铁载体（siderophores），这是一种
宏基因组学技术流程
1、从环境中提取宏基因
组DNA； 2、用核酸内切酶切割成
一定长度的DNA片段
并连接到合适的载体 上；
3、。
一、环境样品DNA提取
提取步骤通常需要满足两个条件：
①尽可能提取样品所有微生物的基因，
②保持片段的完整和纯度。
绝大多数还是未可培养微生物, 对于海洋未可培养微生物的
研究才刚刚展开,如何快速大量地分离、培养和鉴定海洋生 态系统中的微生物，成了深入研究海洋微生物及大规模从海 洋微生物中筛选生物活性物质的瓶颈。
1、海洋微生物难培养的原因
基于16S rDNA序列分析的研究方法显示，海洋中的绝 大多数微生物都未获得纯培养。Kogure等用直接活菌镜检 计数法发现海水中90%以上的细菌都是活的，但是在培养
如对腐殖质含量较高或剪单基因 或小操纵子。而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则适宜径或能够表征环境中未培养微生物基因组的较 大基因片段。
2 化合物结构水平的筛选
化合物结构水平的筛选(Screening on compound structure)是根据不
同结构的物质在色谱中有不同的吸收峰值，通过比较转入和未转入外源基
因的宿主细胞或发酵液抽提物的色来自图，筛选产生新结构化合物的克隆子 。
这一方法可直接筛选到新结构化合物，但不一定有生物活性，且工作量
2、异位裂解法
异位裂解法是先把微生物细胞从环境样品中分离出来，再
从微生物细胞提取DNA并纯化。 优缺点：所得的DNA纯度较高，但DNA产量及所包含的基因组信 息的广泛性不及直接提取法并且操作繁琐、成本高、得率低。
间接提取法提得的DNA片段长度相对较长（20-500Kb2、 化合物结构水平的筛选
3、 序列驱动的筛选 4、 底物诱导的筛选
1 功能驱动的筛选
功能驱动的筛选(Function-driven screening)即基于活性的筛选。 是根据重组克隆产生的新活性而进行筛选的方法。
优点：只要基因能在宿主中表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，能迅速找到
可见的菌落，这些生长快的微生物会产生大量过氧化物、自
由基和超氧化物，这些物质的存在使那些适应能力较差或生 长较慢的微生物细胞受到损伤，从而不能生长。
1、海洋微生物难培养的原因
1.4 生长缓慢的微生物被忽视 当把微生物从原始的生态环境中突然转入人为的环境时 ，适合生长的微生物占据优势地位,它们对营养成分的大量摄
(2)实验室传统的微生物培养方法是平板培养或液体震荡培 养，这种培养方式与海洋微生物原始的生活环境差距太大 ，也会导致微生物的不生长。 (3)目前微生物的培养基只有有限的几种营养成分，不能提 供微生物生长繁殖的一些必须的元素物质。
1、海洋微生物难培养的原因
1.3 氧化胁迫引起细胞损伤 当海洋中的微生物从自然环境突然转入人为环境时，一 些对新环境适应能力较强或生长较快的微生物很快形成肉眼
，其整个细胞常缩小成球形，用常规培养基在常规条件下
培养时不能使其繁殖，但它们仍然具有代谢活性。这时细 菌呈休眠状态，是细菌的一种特殊存活形式。
2、对未培养微生物的研究
由于上述的种种原因，大多数海洋微生物尚未被培 养。目前，对不能进行纯培养的微生物的主要研究是依赖 分子生物学手段，不需要对微生物进行培养，直接提取微
小分子量铁螯合化合物。
1、海洋微生物难培养的原因
研究发现，当向含低浓度铁（含0.1 μM Fe(III)）的 培养基中加入外源的铁载体和C8-HSL(辛酰基高丝氨酸环内 酯)时，原本在低浓度铁培养基上不能生长的海洋细菌也能
形成菌落。这说明本身不能产生铁载体的海洋细菌在其他能
产生铁载体的细菌存在的情况下也能从环境中获取铁，这是 微生物之间的一种共生关系。
一、环境样品DNA提取
样品提取方法 物理法：冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法
化学法：常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等
酶裂解法 依据提取样品总DNA前是否分离细胞，又可以分为原位裂 解法和异位裂解法。
一、环境样品DNA提取
1、原位裂解法（直接提取法） 原位裂解法是在环境样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解然后从 样品中直接提取DNA并纯化的方法。
1、海洋微生物难培养的原因
1.2 培养条件与原生态环境差别太大 由于自然界中微生物数量庞大，其可利用的营养物质极 其匮乏，多数处于“寡营养”状态。常规的微生物培养基
，其营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境，高浓度