• 德 国 学 者 机 制 研 究 ： Helmholtz 、 Doudna 和 、 Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统进行 了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机 制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖 Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。
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CRISPR/cas系统的发现
• 1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷 酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段 简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。
• 随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端 ，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacer DNA），组成成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被 称为CRISPR。
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ZFN的特点和不足
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种
及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3
个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策
略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时
间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽
然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程
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CRISPR-Cas9的工作原理
RISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录 的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复 合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
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TALEN的特点和不足
TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的 位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大 的应用优势， 设计更简单，特异性更高，但仍然有些 问题需要解决，如脱靶效应、TALEN 与基因组进行特 异结合与染色体位置及邻近序列有关等。
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第三代：成簇的规律性间隔的 短回文重复序列
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三代主流技术对比：
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第四代： NgAgo-gDNA技术
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文章的发表（CNS）
沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右）
2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在 被《Science》审稿小半年后被拒，历时9个月终被《Nature Biotechnology》（IF=42）接收并发表。
基因编辑技术的发展
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基因编辑定义
通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸 序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割， 从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。
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四代基因编辑技术
• 第一代: ZFN(锌指核酸酶)，1996年； • 第 二 代 : TALEN( 转 录 激 活 样 效 应 因 子 核 酸 酶 ) ，
度的脱靶效应。
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第二代: 转录激活样效应因子核酸酶 transcription activator-like (TAL) effector
nucleases(TALENs)
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TALEN的组成
TALEN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左 右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基 。 核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二 聚体时切割双链DNA
CRISPR/Cas9系统组成
CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者 的基因武器 ）： • CRISPR序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Sequences）。 • Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes）
由一系列Cys-His锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合 一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶Fok I：
非特异性核酸内切酶FokI， 形成二聚体时切割双链DNA。
锌指蛋白
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ZFN的工作原理
DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ 构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的 双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR) 修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。 HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰， 而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可 造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
2011年； • 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文
重复序列)，2013年； • 第四代：NgAgo-gDNA ，韩春雨，2016；
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第一代: 锌指核酸酶 Zinc-finger nucleases（ZFN）
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ZFN组成
ZFN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：
Fok I
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TALEN技术原理
TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借 助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别 特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所 有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生 成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位 点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。
• 2005年提出假说： CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序 列互补匹配。细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机 制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结 合，起到类似RNA干扰的作用。13ຫໍສະໝຸດ CRISPR/cas系统的发现
• 2007 年 实 验 验 证 ： Danisco 公 司 的 Barrangou 和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸 菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变 细菌对噬菌体的免疫力（Science, 2007） 。