收稿日期:2007-04-13作者简介:黄翊(1980-),男,广东广州人,助理工程师,现从事石油化工设计工作。
纤维素酶水解机理及影响因素黄翊(广东省石油化工设计院,广东广州 510130)摘要:对纤维素酶水解的机理进行了阐述,并初步探讨了各类因素对水解的影响。
关键词:纤维素酶;水解中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1008-021X (2007)05-0029-03The HydrolysisM echan ics of Cellulose and I nfluenc i n g FactorHUAN G Yi(Guangdong Petr oche m ical Engineering Design I nstitute,Guangzhou 510130,China )Abstract :This text expound the hydr olysis mechanics of cellul ose,and p reli m inary discuss s ome influencing fact ors on hydr olyzati on .Key words :cellulase;hydr olyzati on 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一,如将其以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功,那么纤维素资源便可成为人类食粮、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。
但目前有效利用纤维素生物量的主要障碍是纤维素酶的酶解效率低,与淀粉酶比较相差2个数量级以上,进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高,约占纤维素糖化工艺的40%以上,从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。
酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率,降低成本,提供了可能性。
因为固定化酶比游离酶具有较好的稳定性,并且可以重复使用和回收,又便于连续化操作,因而可以大大降低成本。
1 反应机理1.1 纤维素酶的作用机制及理化性质纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。
目前普遍认为:完全降解纤维素至少需要有3种功能不同但又互补的纤维素酶的3类组分:EG (内切葡聚糖酶)、CBH (外切葡聚糖纤维二糖水解酶)和CB (纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶),在它们的协同作用下才能将纤维素水解至葡萄糖。
纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG 在葡聚糖链的随机位点水解底物,产生寡聚糖;CBH 从葡聚糖链的非还原端进行水解,主要产物为纤维二糖;而CB 可水解纤维素二糖为葡萄糖。
需要这三类酶的"协同"才能完成对纤维素的降解。
其中对结晶区的作用必须有EG 和CBH,对无定形区则仅EG 组分就可以。
纤维素酶分子由催化结构域(catalytic domain,CD )、纤维素结合结构域(cellul ose -binding domain,CBD )和一个连接桥(linker )三部分组成。
不同来源的纤维素酶分子其特征和催化的活性不尽相同。
酶分子都被糖基化,糖基化与蛋白质之间以共价键或解离的络合状态存在。
酶分子糖基化的程度决定了酶的多形性和相对分子质量的差别。
近年来,纤维素酶分子结构与功能的研究取得了一定的进展。
不同来源内、外切酶的CD 晶体结构分析结果表明:纤维素酶遵循溶菌酶的作用机制;真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析。
真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大,但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和二维结构上的大小却基本一致,但它们的连接桥和CBD 却存在明显的差异。
真菌纤维素酶的连接桥一般富含Glu,Ser 和Thr,而细菌纤维素酶的连接桥则完全是由Pr o -Thr这样的重复顺序组成。
另一方面,真菌的CBD 由33～36个氨基酸残基组成,且具有高度的同源;而细菌纤维素酶的CBD 由100～110个氨基酸组成,同源性也较低。
在高级结构的分子形状上,真菌纤维素酶的CD 、连接桥和CBD 呈直线连接,CD 与CBD 间为180°,而细菌纤维素酶的连接桥CD 与CBD 之间呈135°。
有限酶切时,真菌纤维素酶只具有一个酶切位点,在靠近CD 与连接桥边结区,酶切时可将CBD 与连接桥一并切去,而细菌的外切酶具有两个酶切位点,有限酶切时,可将CBD 和连接桥分别切去。
真菌的外切酶的CBD 的结构形状呈“楔型”,一面亲水,另一面疏水;结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr,它们位于平坦的亲水面,执行吸附纤维素的功能;细菌外切酶的CBD 很大,且包含很多芳香族氨基酸,它们中的Tr p54和Tr p72暴露于蛋白分子表面,执行吸附功能。
真菌纤维素酶合成后分泌到胞外,它们对纤维素的降解通过内、外切酶之间的协同作用,枯草杆菌、假单孢杆菌、纤维单孢菌可产生胞外内切纤维素酶,而无外切纤维素酶的形成。
高温厌氧纤菌一般形成“纤维素酶小体”(cellul os ome )并在胞壁上形成一个外凸的“小刺”来降解底物。
通常,细菌纤维素酶的降解效率低于真菌。
现代基因克隆技术使纤维素酶系中的单组分酶的分离变得容易,通过基因测序可预推酶蛋白中的功能区及其二级和三级结构[1]。
20世纪80年代至今已有上百种纤维素酶基因被克隆测序,发现氨基酸序列同源性,不只局限于相同来源的同类酶之间,相近种属如细菌、放线细菌、真菌及高等植物的不同类型酶之间,也存在不同程度的同源性。
目前,纤维素酶分解纤维素的分子机制以及结构尚待进一步阐明,将来,以生物化学理论作为依据,采用蛋白质工程方法、构建具有可完全降解结晶纤维素的纤维素酶分子,同时结合底物预处理等技术使其能在生物反应器中高效和重复使用,以提高纤维素酶生物催化活性的效率,应是纤维素酶得以应用的重要途径。
1.2 Sol -gel 法包埋生物分子基本过程S ol -gel 法包埋生物分子的基本过程可参见图1。
图1 Sol -gel 法包埋生物分子过程示意图 首先,前驱体在催化剂作用下发生水解形成均一的溶胶溶液,此时加入生物分子,随着凝胶网络结构的形成和固化,生物分子被逐步包埋于凝胶孔中。
Sol -gel 法是物理包埋过程,凝胶网络是围绕生物分子逐渐形成的,对生物分子尺寸无特殊要求;温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持生物分子的结构完整性和表面微观结构的各向同性;常用的基质材料Si O 2比有机聚合物具有更好的化学和热稳定性,且坚固、抗磨,不易变形。
另外,Sol -gel 中含有足够多的间隙水(interstitial water ),可以为生物分子提供与水溶液环境相同的微环境,从而保持生物分子的反应活性[2]。
Sol -gel 包埋生物分子(如酶)用于实际反应(如酶促反应)时,反应效果不仅取决于生物分子的活性,还与凝胶网络微观结构密切相关[3]。
作为催化剂的酶是被束缚在固体中的,底物分子必须扩散到含酶的凝胶表面和内部才能与酶接触并发生反应,同样,生成的产物也要不断扩散出凝胶。
因此反应效果还取决于底物和产物在溶液和基质间的分配以及底物到达酶处和产物离开基质的扩散阻力。
Sol -gel 法在基质结构设计和裁剪方面具有巨大的优势。
通过调节反应条件,Sol -gel 法形成的基质孔大小可被控制在适宜的尺寸,既可将生物分子牢固地束缚在凝胶网络中,又便于底物和产物的扩散以及底物与生物分子间的反应。
但目前这一方面的研究大多还只停留在工艺水平,缺乏定量的理论指导。
针对传统Sol -gel 过程在生物分子包埋方法的缺陷,人们提出了如下改进措施:①采用超声波促进前驱体的溶解,提高多组分体系的均一分散度和凝胶化速度而无须再外加醇作共溶剂;②在水解后的溶胶中加缓冲溶液调节pH 值,同时稀释水解过程中产生的醇,创造更适宜生物分子的包埋环境;③在低温下老化。
通过这些改进,至今已有许多种类的酶和其他蛋白质被包埋于Sol -gel 法形成的基质中,如葡萄糖氧化酶、铜锌超氧化物歧化酶、细胞色素C 、肌红蛋白、血红蛋白、过氧化氢酶、脂肪酶、大豆过氧化酶、脲酶等,研究表明包埋生物分子的活性得到了很大提高,一般可达到未包埋时的30%～100%,甚至超过了相同条件下在溶液中的活性。
2 分析讨论由以上机理及性质可知,酶分子容易受外界环境影响,进而影响水解效果,从这种变化关系我们可以总结出酶法水解的影响因素。
2.1 预处理对酶解的影响预处理不同程度上引起了结晶度的下降,一般地说,结晶区难以被纤维素酶破坏、降解。
纤维素结晶度的下降有利于纤维素酶的水解。
预处理条件下纤维素植物的可溶木质素含量提高,溶出的木质素含量越高,说明天然植物纤维中木质素减少越多,木质素分布在植物细胞壁的胞间层,由于木质素的破坏、溶出,便会破坏天然植物纤维的结构,有利于纤维素酶的水解作用。
预处理后其结晶度下降、可溶木质索含量较高,纤维形态变化较大,因而推测植物纤维的结晶度、木质素含量及纤维结构形态均一定程度上影响着纤维素酶对纤维素的作用。
2.2 纤维素结构对酶解影响纤维素是由许多D-葡萄糖残基以β-1,4糖苷键联结而成的多糖。
它的聚合度范围非常宽。
纤维素链之间存在着氢键,通过氢键的缔合作用,形成纤维束,分子密度大的区域,成平行排列,形成结晶区;分子密度小的区域,分子间隙大,定向差,形成无定形区;同时又被木质素和半纤维素包围着,形成一种很牢固的结构,所以完整的纤维素高度不溶于水,难于被降解。
而且,不同原料纤维结构的复杂程度也不一样。
据文献报道,纤维素底物对酶解的敏感度受其结构的影响很大,包括纤维中木质素的含量、比表面积、结晶度及聚合度。
因此要提高酶解效率,必须破坏木质素和半纤维素的结合层,改变纤维素的晶体结构。
2.3 酶和酶用量对酶解的影响纤维素酶是一种复合酶,不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异,对纤维素的酶解能力也不大相同。
关于纤维素酶生产菌主要有细菌,放线菌和丝状真菌等,但对纤维素作用较强的菌株多是木霉属(Trichoder ma)、曲霉属(A s pergillus)、青霉属(Penicilliu m)、Pellienlalia属和枝顶孢霉属(Acre moniu m)的菌株,特别是绿色木霉(Trichoder mauirde)及其近缘菌株。
由里氏木霉(Trichoder mareesei)产生的纤维素霉目前应用最广,该酶系中通常含有高活力的内切型及外切型β-葡聚糖酶,但纤维二糖酶活力很低,而许多曲霉属菌种如黑曲霉(A s pergillusniger)等能产生高活力的纤维二糖酶,酶解时常将里氏木霉与黑曲霉产生的酶制剂按一定比例配合使用,能起到更好效果。
纤维素酶用量对酶解也有影响,在一定酶浓度范围内,随着酶量的增加,纤维素酶解率增大。
文献报道,用纤维素酶对麦草进行酶解,在5g底物中,酶用量100mg 之前,酶解速率增加较快,100mg之后,增加缓慢,说明一定量的纤维素在一定条件下,纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限,当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后,再增加纤维素酶用量,起不到酶解作用;另一方面从经济角度考虑,酶用量也要尽可能的少。