实验设计：醋酸菌的分离与纯化
——生物科学2班秦琬莹辛吉瑀张博文一、实验目的
学习醋酸菌的分离纯化、鉴定的原理。

掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。

二.实验原理
1.菌种的分离纯化
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

2.接种操作方法
涂布平板法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

3. 结晶紫
结晶紫是一种碱性染料，也一种极佳的精密酸指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)~弱酸（蓝紫）~中性（紫色）~碱性（赭红色）；所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的结晶紫溶液，既不会影响醋酸菌的生长，又可根据变色圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。

二、材料、用品
1.样品：食醋
2.培养基：
（1）分离纯化平板培养基
葡萄糖1 g，酵母膏1 g，碳酸钙2 g，琼脂2g，水100mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无水乙醇和0.5mL 0.02％结晶紫冰醋酸溶液。

（2）液态发酵培养基
葡萄糖l g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，水100 mL，pH6.5，灭菌后冷却至60 ℃以下加入无水乙醇3.5mL。

3.器材：接种环、冰箱、试管、培养皿、无菌玻璃涂棒、移液管、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅等。

三、醋酸菌分离纯化流程
样品——醋酸菌发酵液中富集培养——稀释分离——纯化——保藏平板培养基保藏
四、实验步骤方法
1.富集培养
取家用食醋以10％的量接入醋酸菌液态发酵培养基富集培养24h。

2.醋酸菌的分离纯化
分别取接种过菌种的富集培养液1mL，用无菌水稀释10、100、1000倍。

分别吸取3个稀释度的稀释液0.2mL于醋酸菌分离纯化平板培养基上，立即用无菌涂布棒涂布平板，倒置于30℃恒温培养箱内，培养24h左右。

若三个平板均未出现单菌落，则重复上述操作，直至有平板出现单菌落。

挑取变色透明圈直径大，菌落丰厚，且占生长优势的单菌落进行纯化。

此时大致可判断产生变色透明圈的单菌落即为醋酸菌。

五、实验记录及数据处理
六、实验结果分析及问题讨论。