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免疫组织化学技术

免疫组织化学技术
( Immunohistochemical technique,IHC )
— 胸腺、脾脏组织中T细胞(CD3)的检测
主要内容
❖ 胸腺、脾脏组织结构 ❖ 免疫组织化学技术的原理及应用 ❖ 免疫组织化学技术的基本操作步骤一Βιβλιοθήκη 胸腺 (thymus)染 色
HE
胸腺结构示意图
T细胞在胸腺中的迁移途径及发育过程
6. 用PBS洗冲洗60s; 7. 每张切片加100μl 链亲和素标记HRP, 37℃孵育10min;
8. 用PBS冲洗60s。
胸腺、脾脏中CD3免疫组化
实验步骤(续)
8. 加50μl DAB显色液,避光5min; 9. 自来水充分冲洗; 10. 滴加50μl 95%乙醇脱水两次,每次3min; 11. 滴加50μl 100%乙醇脱水两次,每次3min; 12. 滴加50μl 二甲苯,静置30s,勿吸干; 13. 滴加5μl 中性树胶; 14. 镜下观察阳性反应细胞(呈深棕色)。
二、脾 (spleen)
脾HE染色
marginal zone (MZ) marginal sinus region (MS) follicle (F) PALS (P) red pulp (RP) A = central artery, T = trabeculus, H = hilus
免疫组织化学技术的基本原理
胸腺、脾HE染色
实验步骤
1. 切片放空气中自然干燥, 95%乙醇固定2 min,水洗约30~60s; 2. 滴加50μl 苏木素,染色5min后,水洗约30~60秒; 3. 滴加50μl 分色液I,约20s后,水洗约30~60秒; 4. 滴加50μl 分色液II,约40s后,水洗约30~60秒; 5. 滴加50μl 伊红,染色2min 后,水洗约30~60秒; 6. 加增色液50μl洗去多余染液,约40s后,水洗60秒; 7. 滤纸吸干, 滴加一滴中性树胶,盖玻片封片。
实验步骤
1. 滴加100μl 封闭液于组织切片上(需完全覆盖待检组织), 37℃孵育10min;
2. 倒掉或吸干液体(不要冲洗); 3.每张切片加100μl 一抗(兔抗鼠CD3) , 37℃湿盒内孵育 45min;
4. 用PBS冲洗60s; 5. 每张切片加100μl 抗兔生物素化二抗, 37℃孵育10min;
原理:应用免疫学基本原理—抗原抗体反应, 对组织或细胞内抗原物质(蛋白质分子)定性和 定位的检测。
分类:按照标记物的种类可分为免疫荧光法、 免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射 免疫自影法等。 用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。
特点:具有抗原抗体反应的特异性,染色技术 的快速性,在细胞或组织上定位的准确性, 以及荧光效应的灵敏性等优势。
胸腺 IHC 4 (阴性)
结果显示(spleen )
脾脏 IHC(纵切面)10
脾脏 IHC(横切面)10
结果显示(spleen )
脾脏 IHC 20
脾脏 IHC 40
脾脏 IHC 100
结果显示(Thymus)
胸腺 IHC 10
胸腺 IHC 40
给小鼠注射地塞米松后,其胸腺里T淋 巴细胞不见了!…….
胸腺 IHC 10 (阳性)
免疫组化原理
具体实验内容
❖采用免疫组织化学技术检测小鼠胸腺、脾脏
组织中T淋巴细胞(CD3分子)
❖小鼠胸腺、脾脏组织HE染色
实验流程图
获取淋巴器官(胸腺、脾) 固定、脱水 冰冻切片
HE染色或免疫组织化学染色
实验材料
❖ 组织切片:2张脾脏组织切片/组
❖ HE染色:苏木素染液、分色液I 、分色液II、伊红、 增色液、ddH2O。
免疫组化染色: 兔抗鼠CD3抗体(一抗) 试剂A(透明瓶,红芯盖): 封闭液,即10%山羊血清。 试剂B(白色瓶,蓝芯盖): 抗兔生物素化二抗 试剂C(黑色瓶,黄芯盖): 链亲和素标记HRP、PBS、DAB显色
液 ❖ 标本保存: 95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、
中性树胶、盖玻片。
胸腺、脾脏中CD3免疫组化
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