四、几种常用的免疫组化检测技术
荧光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能 发出较激发光波长更长的可见光并随照射停 止而消失。 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外 光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检 标本内的荧光物质发出发射光。
四、几种常用的免疫组化检测技术
海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色
⑵非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现 的阳性染色成为非特异性染色。防止非 特异性染色的有效方法是采用与第二抗 体相同的动物源血清（非免疫血清）吸 附封闭底物树脂上的带电荷物质，然后 再进行抗原抗体结合反应，必要时也可 采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少 非特异性染色。
三、免疫组化的全过程
③酶消化处理 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固 定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定 簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性， 因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消 化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、 蛋白酶K等。
三、免疫组化的全过程
2、抗体处理与保存 • 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用 的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗 体。 • 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应 鲜明，背景应浅或不着色。 • 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感 抗体稀释度应越高。（效价指某一物质引起 生物反应的功效单位 ）
• • • • • • • • • • •
免疫组化在临床病理诊断中的应用 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; 协助肿瘤良恶性的诊断; 鉴别低分化癌和肉瘤; 鉴别转移癌的性质; 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; 鉴别小细胞恶性肿瘤; 癌组织耐药基因的检测; 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; 确定肿瘤组织的增殖活性; 评估癌症患者的预后; 检测病原体。
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色（关键步骤）
• 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是
不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视
性标记物。
• 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
复合物；
• 用缓冲液冲洗去未结合的成分；
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增 加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干 扰。 • ⑴蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细 胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大 限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋 白酶等。
四、几种常用的免疫组化检测技术
• 免疫荧光技术将荧光素作为标记物，使组 织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。
• 荧光素：作为染料在激发光照射下能产生 荧光的一类化合物。 • • • • １.异硫氰酸荧光素 FITC ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白
二、免疫组化 2 3 4 荧光 酶 亲和技术 金标
标记抗体
二、免疫组化的检测原理
组织抗原
＋
标记抗体 标记的抗原抗体复合物
二、免疫组化的检测原理
两种免疫细胞化学反应方法
直接法
间接法
三、免疫组化的全过程
免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化 标记物与抗 体集合形成 标记抗体
六、免疫组织化学技术的应用
• 荧光免疫组织化学技术主要用于病原体 感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋 巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫 组化定位等；在病原生物学方面，主要用 于菌种的鉴定和抗原结构的分析；在细胞 免疫学检测中，用以检测淋巴细胞表面的 各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原 和各种膜受体等。
三、免疫组化的全过程
• ①组织材料的固定目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织 细胞的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成 不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率， 造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于 制片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰， 便于辨认。
•
六、免疫组织化学技术的应用
• 酶免疫组织化学技术主要用于组织切片 或其它抗原的定位检测。组织切片中的各 类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、 细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫 球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可 检测。 • 免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜， 目前仍较多用于科研分析。
六、免疫组织化学技术的应用
六、免疫组织化学技术的应用
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鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤 鉴别微小转移癌灶 鉴别某些转移癌的类型 鉴别低分化癌的类型 鉴别低分化肉瘤的类型
七、课堂小结 八、作业: 1、免疫组化的原理 2、免疫组化的操作流程
O(∩_∩)O 谢谢
三、免疫组化的全过程
免疫组化染色中标识物的选择原则： • 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 • 机体内无同一物质或类似物质 • 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结 合，其结合物也稳定
三、免疫组化的全过程
常用标记物 ①荧光素： 最常用的是异硫一氰酸荧光素（荧光显微镜下呈绿色 荧光） 四乙基罗达明（荧光显微镜下发橙红色荧光） ②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色
五、注意事项
1、抗体的保存 • • • 浓缩抗体：有效期内，只需放在4 ℃冰 箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内可保 存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可 放置1-2个月。
五、注意事项
2、出现假阳性的原因 ①组织切片质量不佳，造成假象，如刀 痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为 判断阳性的依据。 ②出血和坏死：红细胞的内源性过氧化 物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物 酶均可出现假阳性反应。 ③抗体的交叉反应。
二、免疫组化的检测原理
• 在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切 片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如果组 织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成 抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素 遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包 括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可 以原位确定组织中或细胞内抗原的分布位置和性质； 经图像分析也可达到定量的目的。 • 组织或细胞中凡是能做抗原或抗体的物质，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、 核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
第10讲
免疫组织化学检测技术
基本内容
一、什么是免疫组织化学 二、免疫组化的检测原理 三、免疫组化的全过程 四、几种常见的免疫组化检测技术 五、注意事项 六、免疫组化技术的应用 七、课堂小结 八、作业
一、定义
• 免疫组织化学是指在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织呈色反应，借 助可见的标记物，对相应的抗原或抗 体进行定位、定性和定量检测的一种 免疫检测方法。
三、免疫组化的全过程
各种抗原的固定 抗原
蛋白质 免疫球蛋白 酶 激素 细菌 病毒 丙酮 四氯化磺 1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇 四氯化磺 类脂质 细胞悬液 10％甲醛 1％聚甲醛
固定剂
95％乙醇
固定温度与时间
室温，3～15min 4℃，30min 4 ℃ ，30min 4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min 4 ℃ ，30～60min 室温，3～10min 室温，2min
三、免疫组化的全过程
4、设立对照实验
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对 第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、 空白对照、自身对照和吸收试验等。
• （1）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染 色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 • （2）阴性对照 用不含已知抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性 对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制 对照等，用以排除假阳性结果。
抗原的提取 与纯化
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处理
三、免疫组化的全过程
1、标本的处理 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细 胞或组织取材新鲜、固定及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。
三、免疫组化的全过程
1、标本的处理 标本的主要来源：活体组织、各种体液、 穿刺液、培养细胞。 主要包括三部分： ①标本的固定与保存 ②制作切片 ③酶消化处理
五、注意事项
3、出现假阴性的原因 ①固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高， 导致抗原丢失，无法补救。 ②固定液不合适或浓度不对，导致固定不 佳。最好使用10%中性福尔马林。 ③抗体浓度过低。 ④孵育时间太短，或孵育温度太低。 ⑤缓冲液pH值不正确。
五、注意事项
4、必须严格设置阳性对照和阴性对照。
5、DAB(二甲氨偶氮苯)有致癌性，用后不 应随处倒弃。
三、免疫组化的全过程
②制作切片： 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方 法。 冰冻 石蜡
切片
切片 观察组织细胞结构的理 想方法，可用于陈旧石 蜡包埋材料的回顾性免 疫组化研究，切片薄， 有连续性，蜡块可长期 保存，但是抗原的保存 量不如冰冻切片。
制片方法简单，可 避免石蜡切片因固 定、脱水、浸蜡等 步骤造成的抗原损 失。迅速冷冻可防 止冰晶的形成，避 免组织细胞结构的 破坏。
三、免疫组化的全过程