变质米饭中霉菌的分离提纯【摘要】粮食是最易被霉菌污染的一种食品原料，霉菌污染会造成粮食的霉烂变质，其产生的毒素会造成人畜中毒，而发霉变质的米饭中就有许多细菌，我们要从众多的细菌中提取我们实验所需要的一种霉菌，所以我们就要进行霉菌的分离与提纯。
培养基是人工配制的适合微生物繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢物。
本实验用的培养基是查氏培养基，它是培养霉菌用的，用以提供氮源、碳源及能源等。
把从变质的霉菌中提取的较纯的霉菌接种到培养基中培养，进而再分离，最后提纯得到纯净单一的霉菌。
然后将得到的霉菌做一些相对应的染色实验，再次验证霉菌的性质。
【关键字】米饭分离提纯鉴定霉菌(mold)是能引起物质霉腐的丝状真菌(Mycelial fungus)的统称，它不是分类学上的名词，而是真菌(Fungus)的一部分。
凡是生长在培养基上成绒毛状或棉絮状菌丝体的菌，都称之为真菌。
霉菌分别属于植物分类学的菌类植物的子囊菌纲(一、comycetes),藻状菌纲(Phycomcetes)和半知菌纲(Fungi imperfecti)。
霉菌在自然界中分布极为广泛，土壤、空气、水和生物体内外到处都有，与人们日常生活关系密切。
霉菌除应用于传统的酿酒、制酱和制作其它发酵食品外，在农业、纺织、食品、医药和皮革等方面都起着极为重要的作用。
但是，不少霉菌(黄曲霉、灰绿曲霉、绿青霉等)能在食品、谷物上生长并产生真菌毒素。
粮食中常常生长的主要是寄生性和腐生性霉菌，其种类约有200多种。
发霉变质的米饭中有许多细菌，要想混杂的细菌群体中获得只含有某一或某一株细菌，就得进行微生物的分离与纯化。
常用方法有：简单单细胞挑取法及平板分离法。
本实验运用平板分离法。
它是根据所分离的微生物的生长条件加入某种物质或选择某一温度、酸碱度等，进行培养，淘汰一些不需要的微生物，从而得到所需的微生物。
1.实验材料和方法1.1材料与仪器1.1.1变质的米饭1.1.2培养基：查氏培养基水500mlNaNO3 2g K2HPO41gKCl 0.5g MgSO4 0.5gFeSO40.01g PH 6.8蔗糖30g 琼脂20g1.1.3实验器材培养皿三角瓶试管酒精灯接种环试管架天平灭菌锅培养箱100ml量筒10ml量筒400ml烧杯震荡器等1.2方法：1.2.1实验前准备米饭处理：取一些米饭，滴上数滴葡萄糖液，再放到潮湿阴凉避风的地方，使其发霉变质，备用。
器皿清洗：用洗衣粉把培养皿洗干净，灭菌备用器皿消毒灭菌：需要灭菌物品用牛皮纸包好后高压蒸汽灭菌试剂配制：乳酸石炭酸棉蓝染色液1.2.2培养基配制按照所示配方将培养基配置完成后，用棉塞赛好，包上牛皮纸，放在高压放在高压灭菌锅中，于121℃~125℃下灭菌30分钟后取出。
灭完菌后趁热倒平板：将其均匀倒入12个培养皿和3支试管中。
其方法是右手持盛培养基的锥形瓶，置火焰旁边，左手拿培养皿并松动锥形瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。
锥形瓶口在火焰上灭菌，然后在左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养皿约20ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养皿均匀分布，平置于桌面上。
（3支试管则是倒斜面）待冷凝后，置37℃培养箱中培养24h，若无杂菌生长，即可使用。
1.2.3无菌水的制备：瓶中放入90 ml.水，另取5支试管各放入9 ml.水，绑好后经高压蒸汽灭菌制备成无菌水。
1.2.4霉菌稀释液的制备：准确称取编制的米饭10g，放入装有90 ml.无菌水并放有小玻璃珠的250 ml.锥形瓶中，置于摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-1稀释液。
再用1 ml无菌吸管，吸取10-1稀释液1 ml，移入装有9 ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入另一支装有9 ml无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-3、10-4、10-5稀释液。
1.2.5霉菌的接种：将1.21中制备好的培养基的三个平板分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三个稀释度。
然后用三支1 ml无菌吸管分别从10-3、10-4、10-5三支霉菌稀释液中吸取0.1ml稀释液对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌铁推棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（每种稀释度培养基编号设3个重复。
）将涂抹好的平板平在桌上静置20～30min，使菌液渗透入培养基内。
1.2.6霉菌的培养：将接种好的霉菌平板倒置（即皿盖朝下放置），放在27℃恒温箱中培养48h。
若出现圆形稍扁平的黄色菌落，其周围培养基亦为黄色者初步鉴定为霉菌。
1.2.7霉菌的平板菌落计数：选择平均菌落数在30～300之间的稀释度作为菌落总数测定标准，乘以稀释倍数。
1.2.8划线分离：从上述接种培养好的培养基中挑选出菌落生长最好的某浓度下的霉菌，将其单个菌落分别挑取接种到另外3个平板培养基中（用划线法接种）。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置，放入27℃恒温箱中继续培养。
1.2.9霉菌的纯化：挑取生长得较好的霉菌，用划线法将菌接种到3支已备好的试管斜面培养基中，放入27℃恒温箱中继续培养。
2.实验结果2.1分部进行，并对结果进行观察在培养好的培养基中挑选出菌落生长最好的某浓度下的霉菌后，将其单个菌落分别挑取用划线法接种到另外3个平板培养基中，放入27℃恒温箱中继续培养，看见了颜色较纯的黑色菌落，再从从3个培养基中再次挑取生长得较好的霉菌，用类似方法将菌接种到3支已备好的试管斜面培养基中，放入27℃恒温箱中继续培养，得到了我们本次实验的实验成果。
2.11霉菌平板菌落计数实验结果稀释浓度为10-5的菌落生长示图分离提纯后的平板纯种黑曲霉2.12镜检观察用水浸片观察法对菌体进行观察。
在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从平板培养基里提取少量带有孢子的霉菌菌丝，放入载玻片的液滴中，盖上盖玻片，用低倍镜观察后转入高倍镜即可看见黑色的孢子囊以及透明的分生孢子梗。
镜检观察后确定为黑曲霉且无杂菌。
2.2简便方法的对照将长势良好的菌落直接挑取菌种接入平板培养基中放入27℃恒温箱中培养，一段时间后拿出来对其进行镜检，显微镜下看到的同样为纯种的黑曲霉，无其他杂菌，镜检后将其接种于斜面试管中放回27℃恒温箱中培养，数天后将经过划线步骤处理的试管与未经划线处理的试管一同对照，外观上大致相同，并未发现其余异常情况。
此方法省略了常规实验中的划线步骤对菌种进行提纯，这种做法不仅可以提高实验效率缩短试验的完成时间，还因为不用经过划线步骤才对菌种进行分离在原料的用量上也可以达到一定的节约效果。
试验结束后，选取长势良好，品质优秀无杂菌的一只试管上交为本次试验的成果。
通过本次试验以及对实验结果的对比分析，由此结果可看出稀释度为10-4时的菌落平均数为40，介于30～300之间，依据实验原理，应选择稀释度为10-4时的菌落平均数作为菌落总数的测定标准。
因此所用饭团样品中每g样品的菌数（个／克）＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数＝40×10×10-4＝4.0×10-33.实验分析与小结3.1实验证明，饭团变质后会生长许多的微生物，其大多数为霉菌，而霉菌的种类繁多，在不同的环境条件下所生长的主要菌种又会有各有差异，但不论生长的是何种霉菌，绝大多数霉菌都会长出菌丝体，因为霉菌不同于细菌及酵母菌，绝大多数是多细胞的微生物，由菌丝构成的，菌丝可无限伸长和产生分枝，分枝的菌丝相互交织在一起，形成了菌丝体。
3.2不同种类的霉菌对环境的要求也会有不同，如温度、PH值、湿度等都会造成培养出来的霉菌种类有所差异，因此本次试验在PH值为6.8，温度为27℃的情况下培养得到的菌种为黑曲霉，并且通过镜检观察得到了证实。
3.3试验开始时在菌种的稀释与第一次接种有些仪器使用以及操作上的不熟练造成了小失误，导致有的不同浓度培养基生长情况出现类似，以及第一次接种时灭菌操作的疏忽导致杂菌的侵入，所以第一次的培养基上生长着较多杂菌给下一步菌种的分离提纯工作带来了许多不便。
3.4培养基内的营养物质对所培养的菌体起着关键性的作用，某些物质甚至直接影响某种菌体的生长，由于称量与溶解时浪费了一些材料，在倒好平板后发现某些培养基的颜色比较深某些培养基的颜色比较浅，初步断定为培养基所含的某种物质在每个培养基中的含量不一，实验中发现培养基颜色较浅的培养基菌种生长较为旺盛并且菌落较纯。
总的来说，我们本次试验是比较成功的，我们成功从变质的饭团内分离出了黑曲霉，并且将其将其进行了纯化培养，成功上交了我们的实验成果。
在为时长达两个半星期的试验中，整个实验过程都让我们受益匪浅。
并且本人发现在菌落较为稀疏的培养基中进行下一步分离培养会比较方便快捷，且经过第二次培养以后的培养基各菌落生长良好并且已经达到了一定的分离纯化目的，通过对比实验证明，不用经过划线步骤同样也可以提取到纯种的菌体，可直接在菌落生长茂盛且菌种特征明显的地方直接挑取纯种进行纯化培养，同样能得到纯种的菌体，并且与按照课本步骤试验出来的上交的成果不相上下。
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