• 3.2获得无菌外植体：
• 自来水下冲洗5 min，然后置于5%的次氯酸钠溶液浸泡15 min，再置于75%的酒精中浸泡20 s，然后用无菌水冲洗 3~5次
图1 发芽的马铃薯
图2 切下的茎尖 注:茎尖下方为医用四号针头(直径0. 4 mm)作为参照物。
4.脱毒苗病毒检测
• 核酸斑点杂交(Nucleic acid spot hybridization， HASH) • 1)提取PVY的全长RNA，变性，将变性混合物点 样在预先经处理的NCM膜上，烘烤； • 2)使用DIG- DNA标记试剂盒制备由地高辛标记的 PVY探针； • 3)点样后的NCM膜先在预杂交液中进行预杂交， 然后在杂交液中进行杂交，洗涤； • 4)杂交物与抗DIG碱性磷酸酯酶反应，洗涤，加 入底物。
马铃薯组织培养技术的研究进展
内容简介
• • • • • 1.马铃薯概况 2.培养基 3.外植体 4.脱毒苗病毒检测 5.马铃薯组织培养技术的应用---优质种苗的 快速无性繁殖（快繁、工厂化生产）
1.马铃薯概况
• • • • 科 属：茄科、茄属 起 源：拉丁美洲和安第斯山脉高原地区 存在问题：种薯质量差，品种退化 解决方法：利用组织培养技术对马铃薯茎类 脱毒、生产无毒种苗和微型脱毒种薯
5.马铃薯组织培养技术的应用--优质种苗的快速无性繁殖
5.1马铃薯标准化组织培养快繁技术（见后面） 5.2简化的培养方法 ：
• 1)以自来水替代蒸馏水； • 2)以普通食用白糖替代蔗糖；
• 3)以普通棉为悬浮物替代4.5%的琼脂作为支持物。
5.1马铃薯标准化组织培养快繁技术
• 外植体：剪取经过热处理的发芽块茎的茎尖1~2cm，清水漂洗， 剥去外面叶片。 • 消毒方法：0.1%HgCl2消毒8~10 min，无菌水冲洗4~5次。 • 诱导培养基：MS+GA30.2mg/L+NAA 0.55mg/L+6-BA0.5mg/L。 • 检测培养植株脱毒效果：电子显微镜检测、血清检测或植物接种 检测。 • 快繁所需培养基：1.7 ml/每个芽。 • 继代培养周期：20~30d • 快繁切割技术：以带一个腋芽的茎段为一个单位，剔除异常芽。 • 繁殖系数：3~4/继代周期。 • 培养条件：温度：25~27℃，光照强度：2000~3000lx，每日光 照：10~12h 。 • 炼苗：生根培养15d以后，置于可控制光强的遮荫棚内，炼苗 5~10d 。 • 移栽：培养瓶生长的试管苗，达到株高3~5cm具7~8片叶，叶片 绿色，根系生长良好时，从瓶中小心取出，洗去根部培养基，移 栽于隔虫温(网)室中。
2.培养基
• 2.1诱导愈伤组织：
• 2,4-D 1.5~2.0mg/L • 低浓度的GA3促进愈伤组织的形成、100mg/L硫酸腺嘌呤 和100mg/L水解乳蛋白促进愈伤组织的生长
• 2.2诱导生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：
• MS+GA30.1mg/L+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L • MS+GA30.2mg/L+NAA0.1mg/L+KT0.5 mg/L
• 2.3诱导发芽：
• MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.3mg/L
3.外植体
• 3.1外植体的种类：
• 叶片0.5cm2、块茎0.25cm2 X 0.3cm 、茎0.5cm、原生质 体 • 茎尖切取控制长度在1.0~1.5mm，带有3~4个叶原基可以 取得成活率与不带毒的相对平衡（图2)。快繁可取数毫米 大小，脱病毒培养要求取小于1mm的茎尖。